Graves病患者Th17細(xì)胞相關(guān)因子和GITR mRNA檢測(cè)及臨床意義.pdf

1、目的： 探討Th17細(xì)胞相關(guān)因子在Graves病(Gravesdisease，GD)中的變化。并通過建立檢測(cè)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT—PCR)的檢測(cè)方法，檢測(cè)GD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中GITRmRNA的表達(dá)水平。 方法： (1)運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)GD未治療組(n=22)、GD臨床緩解組(n=23)患者及健康對(duì)照組(n=18)血漿中甲狀腺激素(FT

2、3、FT4和TSH)含量。 (2)各組PBMC經(jīng)PMA(50ng/ml)和Ionomycin(1μg/ml)刺激5h后，提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用QRT—PCR檢測(cè)RORγt、IL-17及β—actinmRNA的含量，以β—actinmRNA作為內(nèi)參，以RORγt/β—actinmRNA和IL-17/β—actinmRNA的比值作為它們相對(duì)表達(dá)水平的指標(biāo)，并評(píng)價(jià)GD未治療組患者RORγt、IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)水

3、平與其甲狀腺激素水平的相關(guān)性。同時(shí)，應(yīng)用ELISA檢測(cè)血漿中IL-17和IL-23的水平。 (3)采用RT—PCR方法，從人PBMC獲得hGITR基因片段，克隆至pMD18—T載體，轉(zhuǎn)化E．coliDH5α宿主菌，行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行酶切、PCR及測(cè)序鑒定，制備含hGITR基因的重組質(zhì)粒。建立檢測(cè)GITRmRNA的QRT—PCR方法，并評(píng)價(jià)該方法的線性范圍、特異性及精密度水平。應(yīng)用QRT—PCR檢測(cè)上述PBMC中GIT

4、R和β—actinmRNA的含量，以GITR/β—actinmRNA的比值作為GITRmRNA相對(duì)表達(dá)水平的指標(biāo)，并評(píng)價(jià)GD未治療患者GITRmRNA相對(duì)表達(dá)水平與其甲狀腺激素水平的相關(guān)性。同時(shí)也評(píng)價(jià)GD未治療組患者及健康對(duì)照組PBMC中GITRmRNA相對(duì)表達(dá)水平與RORγt和IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性。 結(jié)果： (1)GD未治療組患者血漿中FT3、FT4水平均明顯高于GD臨床緩解組和健康對(duì)照組(P＜0.0

5、5)，TSH水平明顯低于GD臨床緩解組和健康對(duì)照組(P＜0.05)。而GD臨床緩解組血漿中甲狀腺激素水平與健康對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (2)GD未治療組患者PBMC中RORγtmRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于GD臨床緩解組(x2=11.76，P＜0.01)和健康對(duì)照組(x2=6.62，P＜0.05)，而在GD臨床緩解組和健康對(duì)照組之間其表達(dá)水平無明顯差異(x2=0.42，P＞0.05)。同樣，GD未治療組患者PB

6、MC中IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于GD臨床緩解組(x2=20.91，P＜0.01)和健康對(duì)照組(x2=26.92，P＜0.01)，而在GD臨床緩解組和健康對(duì)照組之間無明顯差異(x2=0.84，P＞0.05)。GD未治療組患者血漿中IL-17水平明顯高于GD臨床緩解組(x2=26.67，P＜0.01)和健康對(duì)照組(x2=32.08，P＜0.01)，而在GD臨床緩解組和健康對(duì)照組之間無明顯差異(x2=0.68，P＞0.05)。GD

7、未治療組患者RORγt、IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)水平與其FT3、FT4均呈正相關(guān)(P＜0.05)，而與TSH均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。同樣，GD未治療組患者血漿中IL-23水平明顯高于GD臨床緩解組(x2=23.91，P＜0.01)和健康對(duì)照組(x2=35.88，P＜0.01)，而在GD臨床緩解組和健康對(duì)照組之間無明顯差異(x2=2.01，P＞0.05)。 (3)pMD18T—hGITR重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定可見103bp的

8、目的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示與GenBank中GITRmRNA序列完全一致。通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，成功建立檢測(cè)GITRmRNA的QRT—PCR方法，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r2為0.999，線性范圍為(101～106)copies/μl，最低檢出限達(dá)101copies/μl，批內(nèi)CV為6.4％，批間CV為13.7％和10.2％。檢測(cè)結(jié)果表明GD未治療組患者PBMC中GITRmRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于GD臨床緩解組(x2=18.48，P

9、＜0.01)和健康對(duì)照組(x2=18.26，P＜0.01)，而在GD臨床緩解組和健康對(duì)照組之間無明顯差異(x2=0.12，P＞0.05)。GD未治療患者GITRmRNA相對(duì)表達(dá)水平與其FT3(r=-0.509，p=0.015)、FT4(r=-0.483，p=0.023)均呈負(fù)相關(guān)，而與TSH呈正相關(guān)(r=0.458，p=0.032)。GITR與RORγtmRNA相對(duì)表達(dá)水平在GD未治療組(r=-0.475，p=0.009)和健康對(duì)照組(

10、r=-0.436，p=0.011)均呈負(fù)相關(guān)。同樣，GITR與IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)水平在GD未治療組(r=-0.536，p=0.002)和健康對(duì)照組(r=-0.492，p=0.008)也均呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： (1)本研究結(jié)果提示GD患者體內(nèi)Th17細(xì)胞相關(guān)的RORγt、IL-17和IL-23表達(dá)水平明顯增高。 (2)本研究建立的檢測(cè)GITRmRNA的QRT—PCR方法靈敏、特異且重復(fù)性好。檢測(cè)結(jié)果表明GD患