金黃色葡萄球菌一氧化氮自由基誘導乳酸脫氫酶晶體結構解析和酶活性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是最常見的革蘭陽性致病菌，可以引起人體種類眾多的感染。而且，隨著抗生素的廣泛使用，耐藥性問題越來越嚴重。萬古霉素作為治療耐藥金黃色葡萄球菌感染的最后一道防線，也出現(xiàn)了敏感性降低，甚至完全耐藥的現(xiàn)象。其實，人類的自身先天免疫系統(tǒng)是有效抗擊外來微生物入侵的第一道防線。其中一種重要的機制就是誘導性一氧化氮合成酶系統(tǒng)，其所合成的NO*可以直接抑制微生物的有氧呼吸能量代謝，并抑制微生物的

2、DNA復制。而金黃色葡萄球菌區(qū)別于其他非致病性葡萄球菌的一個主要特征，就是可以抵抗NO*的毒性，在外源性NO*壓力下仍能生長和繁殖。其NO*解毒機制一方面與黃素血紅蛋白（hmp SACOL0220）行使的NO*雙氧化酶功能有關，可以將毒性NO*轉化為無毒的硝酸；另一方面與hmp同處于一個操縱子中的金黃色葡萄球菌乳酸脫氫酶-1（ldh-1 SACOL022）的誘導高表達密切相關。ldh-1與金黃色葡萄球菌中持續(xù)表達的同功酶ldh-2可以改

3、變金黃色葡萄球菌在NO*生存環(huán)境下細菌的能量代謝途徑，從而使金黃色葡萄球菌可以在NO*環(huán)境壓力下正常生長和繁殖。 研究思路：理論上ldh-1蛋白可以作為一個抗金黃色葡萄球菌的潛在靶點，任何對ldh-1具有選擇性抑制作用的小分子物質，即只抑制金黃色葡萄球菌ldh-1但對人類的乳酸脫氫酶同功酶無明顯抑制作用，就可能成為一種新的抗生素。 研究方法：本研究首先將金黃色葡萄球菌中編碼ldh-1和ldh-2的基因全長克隆到表達載體p

4、ET-28a中，大量表達重組蛋白，再利用重組蛋白的Histag，以親和層析法和分子篩兩步聯(lián)合方法純化重組蛋白純度超過95%。進而，在不同理化條件下促使蛋白結晶，然后用所得到的單晶進行X射線衍射以解析蛋白的三維機構。 研究結果：l；dh-1蛋白結晶，并收集高質量衍射數(shù)據(jù)。初步分析屬于C2空間群，晶胞參數(shù)為a=131.36，b=74.362，c=103.243。ldh-1的結構最終可以被精修到2.2 A，R-Factor為17%，R

5、free-factor為23.4%。使用分子置換法解析出其三維結構，分辨率達2.2埃。每個晶胞中有兩個不對稱的乳酸脫氫酶分子。每個ldh-1分子中包含兩個結構域。大的結構域由22-160和248-264號氨基酸形成具有典型Rossmann特征的折疊。通過蛋白一級結構氨基酸序列的多重序列比對，活性位點的關鍵氨基酸序列保守，但活性環(huán)區(qū)上翹，使活性位點更加暴露。本研究還對ldh-1、ldh-2、人類骨骼肌ldh-A和心肌ldh-B的酶催化活性