水稻種胚特異基因OsESG1的生物學(xué)功能分析.pdf

1、類受體蛋白激酶（receptor-like kinase，RLKs）是植物蛋白激酶的一個家族，它作為信號分子的受體，能夠通過胞外受體結(jié)構(gòu)域感受外界刺激，并通過胞內(nèi)激酶域進(jìn)行磷酸化或去磷酸化，對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物生長發(fā)育及環(huán)境應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。類受體蛋白激酶根據(jù)胞外結(jié)構(gòu)的不同可以分為四類，其中具有S結(jié)構(gòu)域(S-domain)的類受體蛋白激酶（S-RLKs）是比較重要的一類，目前，部分S-RLK

2、s已被克隆，證明其在植物發(fā)育及自交不親和等方面發(fā)揮作用，但該類蛋白激酶參與脅迫響應(yīng)的報道較少。
　　實驗室前期在水稻中克隆了一個種胚特異基因，命名為OsESG1（HE584611），該基因編碼一個S-RLKs。結(jié)合基因工程技術(shù)，通過構(gòu)建反義OsESG1表達(dá)載體，結(jié)合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了該基因的反義轉(zhuǎn)基因水稻，命名為AOsESG1（簡寫為AS）。
　　本研究中，主要通過將OsESG1進(jìn)行原核蛋白表達(dá)，并對基因表達(dá)特異性

3、進(jìn)行分析，結(jié)合OsESG1在不同處理條件下的表達(dá)模式，進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因水稻AS的表型及其在鹽、干旱等條件下的生物學(xué)功能進(jìn)行研究，結(jié)合對轉(zhuǎn)基因水稻中差異表達(dá)基因的篩選，力圖全面闡明OsESG1基因功能，并為構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供線索及證據(jù)，相關(guān)研究結(jié)果如下：
　　1、OsESG1的原核表達(dá)：構(gòu)建OsESG1的原核表達(dá)載體OsESG1-pET-28a(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到約80 kDa的蛋白質(zhì)條帶。蛋白的表達(dá)量隨

4、著誘導(dǎo)時間延長而增加，在誘導(dǎo)7h后達(dá)到最高表達(dá)量，之后隨誘導(dǎo)時間的延長，蛋白表達(dá)量基本不變，維持在一定的水平。不同濃度的IPTG對蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)能力有所不同：低濃度的IPTG幾乎不能誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，隨IPTG濃度升高，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)量也逐漸升高，在IPTG濃度升高至1 mmol后，其對蛋白的誘導(dǎo)能力穩(wěn)定在一定水平，不再升高。
　　2、OsESG1的表達(dá)模式分析：利用半定量RT-PCR的方法對OsESG1的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：

5、OsESG1在水稻種胚中表達(dá)量較高，在其他器官中有少量表達(dá)；經(jīng)ABA、Me-JA、GA3處理后，OsESG1在水稻葉片被誘導(dǎo)表達(dá)，IAA對OsESG1在水稻根中的表達(dá)具有一定的抑制作用。高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫能夠誘導(dǎo)OsESG1在水稻根中的表達(dá)，其中干旱對基因的誘導(dǎo)作用較明顯。
　　3、OsESG1的生物學(xué)功能研究：以轉(zhuǎn)基因水稻 AS為材料，對OsESG1的生物學(xué)功能進(jìn)行分析。對轉(zhuǎn)基因水稻的表型分析顯示：轉(zhuǎn)基因水稻的不定根數(shù)

6、目減少，初生根長度也受到一定程度的抑制，顯示OsESG1在調(diào)控水稻根系發(fā)育過程中具有一定的作用。通過對在干旱處理下轉(zhuǎn)基因水稻相關(guān)生理指標(biāo)的測定顯示：干旱條件下轉(zhuǎn)基因水稻失水較快、MDA大量積累、膜損傷程度高于對照。轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱能力低于野生型，顯示OsESG1表達(dá)量的降低對水稻抗旱能力有一定影響，OsESG1可能在水稻的抗旱過程中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)基因水稻在黑暗條件下葉片衰老程度高于對照，暗示OsESG1可能參與水稻的衰老進(jìn)程。
　　

7、4、高通量表達(dá)譜的測定：利用RNA-Seq技術(shù)篩選并分析轉(zhuǎn)基因水稻的差異表達(dá)基因（Different expression genes，DEGs），結(jié)果顯示，相對于對照材料，轉(zhuǎn)基因水稻內(nèi)1072個基因表達(dá)上調(diào)，740個基因表達(dá)下調(diào)。DEGs表達(dá)的蛋白質(zhì)主要分布于細(xì)胞質(zhì)，其功能集中在陽離子結(jié)合過程。對其中部分基因的表達(dá)模式進(jìn)行 qRT-PCR驗證，結(jié)果證實參考基因的表達(dá)模式與表達(dá)譜結(jié)果測定相符合，結(jié)果可信。結(jié)合基因的功能分類，進(jìn)一步分析差

8、異表達(dá)基因。其中生長素相關(guān)基因如2個Aux/IAA家族基因表達(dá)上調(diào)，7個SAURs家族基因表達(dá)下調(diào)，從而顯示OsESG1基因表達(dá)變化導(dǎo)致IAA參與調(diào)控的相關(guān)功能受到一定程度的影響，進(jìn)一步影響根部的發(fā)育及表型，與轉(zhuǎn)基因水稻根系發(fā)育變化的表型一致；部分其它激素相關(guān)的基因表達(dá)也發(fā)生了不同程度的變化，其中細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶—異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族的7個基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞分裂素脫氫酶基因家族的2個基因表達(dá)上調(diào)，相關(guān)基因的表達(dá)變化會導(dǎo)致細(xì)胞分裂素

9、合成抑制，顯示OsESG1基因表達(dá)的變化導(dǎo)致細(xì)胞分裂素的水平降低，這與轉(zhuǎn)基因水稻暗誘導(dǎo)的葉片衰老程度加劇表型一致；同時，其他參與代謝調(diào)控及脅迫響應(yīng)等過程的部分基因的表達(dá)也發(fā)生改變，其中過氧化物酶基因家族的12個基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻抗氧化能力降低，部分轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也發(fā)生變化，其中5個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)明顯下調(diào)，對轉(zhuǎn)基因水稻的干旱響應(yīng)能力產(chǎn)生影響，與轉(zhuǎn)基因水稻抗旱能力降低一致。
　　綜上所述，本研究首先對OsESG1進(jìn)