當(dāng)歸、紅芪及其合劑超濾膜提取物促缺血心肌血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、當(dāng)歸、黃芪是中醫(yī)補(bǔ)血、益氣的常用藥物，兩藥按1：5配伍組成著名的當(dāng)歸補(bǔ)血湯，為中醫(yī)補(bǔ)血生脈的基本方。紅芪作為黃芪的代用品，在臨床廣泛應(yīng)用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸、紅芪具有一定的抗心肌缺血的作用，但由于其化學(xué)成分復(fù)雜，目前尚難以確定其藥效成份。本論文應(yīng)用超濾膜分離技術(shù)精制當(dāng)歸、紅芪及其合劑水提液，應(yīng)用大鼠心肌梗死模型、血流動力學(xué)監(jiān)測、血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚尿囊絨毛膜實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)，對當(dāng)歸、紅芪及其合劑50000分子量以下水提物促血管

2、新生的作用進(jìn)行了研究，主要研究內(nèi)容有以下幾個方面： 1.應(yīng)用陶瓷膜微濾和聚丙烯腈(PNA)中空纖維超濾膜(截留分子量為5萬子量)精制當(dāng)歸、紅芪及其合劑水提物。 2.建立大鼠急性心肌梗塞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。Wistar大鼠用1％戊巴比妥鈉麻醉后，切開頸部皮膚暴露氣管，經(jīng)口氣管插管，人工呼吸，經(jīng)左胸第3、4肋間純性分離開胸，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。本法手術(shù)成功率72.6％，術(shù)后72小時內(nèi)大鼠死亡率僅為3.2％；本技術(shù)操作簡單，創(chuàng)傷輕、成

3、功率高、結(jié)果可靠。 3.為探討當(dāng)歸、紅芪超濾膜提取物對雞胚尿囊絨毛膜新生血管生成的影響，制備CAM模型，觀察應(yīng)用當(dāng)歸、紅芪及其合劑(1：5)超濾膜提取物后CAM血管生成情況。結(jié)果表明當(dāng)歸和當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物均有明顯的促血管新生作用，而紅芪未顯示有促血管生成作用。提示當(dāng)歸超濾膜提取物具有促進(jìn)CAM血管生成的作用，而當(dāng)歸與紅芪配伍后促進(jìn)CAM新生血管生成的作用更好。 4.為探討當(dāng)歸、紅芪及其合劑超濾膜提取物是否對人臍靜

4、脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)具有促增殖作用，并進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因在此過程中的作用，以離體培養(yǎng)的ECV-304細(xì)胞為摸型，采用四氮唑藍(lán)比色法(MTT法)測定細(xì)胞增值，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR))法檢測VEGFmRNA表達(dá)的變化；觀察了當(dāng)歸、紅芪及其超濾膜提取物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV-304)增殖作用的影響。結(jié)果表明當(dāng)歸及當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對ECV-304細(xì)胞有促增

5、殖作用，并具有下調(diào)細(xì)胞周期中G<,0>／G<,1>期細(xì)胞數(shù)目，上調(diào)s期細(xì)胞數(shù)目的作用，尤以當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物作用明顯。單用紅芪超濾膜提取物無此作用；在ECV-304細(xì)胞增殖過程中，當(dāng)歸及當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物能夠誘導(dǎo)VEGFmRNA的表達(dá)，并呈一定的量效正相關(guān)。 5．用結(jié)扎冠狀動脈制備大鼠心肌梗塞模型，采用拉丁方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，32只雄性wistar大鼠隨機(jī)分成3d、7d、14d、21d組后，觀察大鼠心肌梗塞和服藥后MAP、心

6、肌酶和血清NO的變化。結(jié)果表明大鼠急性心肌梗塞14d后MAP逐漸升高，LDH、cK-MB和AST在7-14d降低；心梗后24h，大鼠血清NO水平增高，3d后下降；各服藥組大鼠MAP、LDH、cK-MB和NO有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示心梗和用藥時間對大鼠MAP、心肌酶和NO有明顯影響，而中藥對心肌的保護(hù)作用可能與用藥時間長短有關(guān)。 6．為了觀察當(dāng)歸、紅芪超濾膜提取物對急性心肌缺血大鼠心肌毛細(xì)血管密度和病理形態(tài)的影

7、響，探討其保護(hù)缺血心肌的機(jī)制。建立大鼠急性心肌梗塞模型，采用拉丁方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將32只雄性wistar大鼠隨機(jī)分成3d、7d、14d、21d組，每日灌胃當(dāng)歸、紅芪及其合劑超濾膜提取物2次，制模后3d、7d、14d、21d分別取材，用堿性磷酸酶組織化學(xué)法染色，系統(tǒng)分析缺血心肌內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管密度。結(jié)果表明當(dāng)歸紅芪合劑(<5000分子量)組大鼠缺血心肌內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管密度明顯高于其它藥物組，心梗7-14d組大鼠心肌內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和毛細(xì)血管