白術(shù)黃芪方、白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪注射液對Caco-2單細胞層屏障影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：祖國醫(yī)學(xué)認為，脾胃為氣血生化之源，后天之本。脾的功能旺盛才能保證機體健康、抵御外邪侵襲。如《靈樞·五癃津液別》篇云：“脾為之衛(wèi)”。腸道擁有與外界相接觸的最廣大面積，許多毒素和致病因子如細胞因子等可經(jīng)破壞的腸道屏障進入血液循環(huán)，不僅引起局部損害，亦可導(dǎo)致全身疾病。所以研究益氣健脾方藥對腸道屏障的作用具有重要的意義。 腸道屏障包括機械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障。腸道機械屏障主要由腸粘膜上皮細胞、細胞間緊密連接等構(gòu)成

2、。腸上皮細胞包括多種生物功能不同的細胞，是腸道機械屏障的主要組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 腸上皮細胞之間一種特殊的膜性結(jié)構(gòu)——緊密連接(tightjunction)，位于基底外側(cè)細胞與細胞間的最上端，對來自于腸道的眾多毒素和免疫原起著首當(dāng)其沖的抵御作用，它是維持腸粘膜通透性(mucosapermeability)的重要組織成分，生理情況下只能允許2μm大小的離子或小分子物質(zhì)通過，以溝通機體內(nèi)、外環(huán)境，緊密連接調(diào)節(jié)著離子、水分子、大分子甚至癌細

3、胞的通路，因此與水腫、腹瀉、血性轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)；任何原因使緊密連接成分發(fā)生改變，或直接損傷了緊密連接，都會造成腸粘膜對腸內(nèi)容物的通透性增高，細菌或毒素等得以入侵體內(nèi)，激起一系列病理生理改變。 益氣健脾中藥是治療脾虛證的主要藥物，由黨參、白術(shù)、黃芪、甘草等為主要藥物組成的四君子湯、補中益氣湯、黃芪建中湯、參苓白術(shù)散、白術(shù)黃芪湯等是治療脾虛證的經(jīng)典方劑。益氣健脾中藥可通過影響腸道機械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、生物屏障而發(fā)生作用。具體

4、體現(xiàn)在促進腸上皮細胞修復(fù)、清除毒素和減少致炎因子、減少細菌移位和調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)、促進腸道分泌SIgA、改善腸道血循環(huán)等方面。 現(xiàn)代藥理研究認為益氣健脾方藥能增強和調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的功能，對胃腸粘膜有增強屏障功能，有促進粘膜防護因子分泌等作用。益氣健脾方藥主要用于治療有脾虛表現(xiàn)的病證，而脾虛證反映了以消化系統(tǒng)功能障礙為主的全身性綜合病理狀態(tài)，在脾虛患者或脾虛動物的腸上皮細胞及上皮細胞之間的細胞連接可出現(xiàn)異常，因此益氣健脾中藥對脾虛證

5、的作用機理之一可能是對胃腸粘膜的保護或修復(fù)。 本實驗室2000年引進了大鼠小腸隱窩干細胞(intestinalepithelialcellline，IEC-6)，將其用于胃腸粘膜修復(fù)藥物作用的研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪注射液(主要含黃芪皂苷)可促進IEC-6細胞分化和遷移，亦可促進IEC-6細胞白介素6(IL-6)的分泌；白術(shù)AMPS-Ⅱ(主要含白術(shù)糖復(fù)合物)具有促進IEC-6細胞分化的作用，可明顯改變IEC-6細胞的形態(tài)，其影響程

6、度與藥物作用的劑量和時間呈正相關(guān)，并可通過激活鳥氨酸脫羧酶促進IEC-6細胞移行，可刺激IEC-6細胞的絨毛蛋白mRNA表達；甘草總黃酮可明顯促進IEC-6細胞增殖。 近年來本實驗室對由白術(shù)、黃芪、甘草的有效提取部位所組成的新方白術(shù)黃芪方進行了藥理研究。白術(shù)黃芪方來源于金元四大家之一劉完素的《素問病機氣宜保命集·卷中·瀉痢論·第十九》中的：“白術(shù)黃芪湯：服前藥。痢雖已除。猶宜此藥和之?！仔g(shù)一兩，黃芪七錢，甘草三錢”?？梢姲仔g(shù)

7、黃芪湯治療腸道炎性疾病緩解期、恢復(fù)期“痢”淵源已久。我們根據(jù)在細胞株和動物模型的實驗結(jié)果，用白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪總皂甘、甘草總黃酮經(jīng)均勻設(shè)計配伍組成新的方劑“白術(shù)黃芪方”，在動物實驗結(jié)果表明該方可以治療動物潰瘍性結(jié)腸炎，減輕其炎癥程度，促進損傷粘膜的修復(fù)。本論文根據(jù)以上工作基礎(chǔ)，進一步研究益氣健脾方藥對聚碳酸酯膜上培養(yǎng)的人結(jié)腸上皮細胞Caco-2單細胞層的藥理作用，觀察白術(shù)黃芪方、白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪注射液對Caco-2細胞增殖、單

8、細胞層通透性、緊密連接及其相關(guān)蛋白ZO-1表達的影響，從結(jié)腸上皮單細胞層形態(tài)和功能方面探討益氣健脾方藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的細胞藥理機制。 研究方法與結(jié)果1.MTT法觀察Caco-2細胞的生長曲線實驗方法：Caco-2細胞購自上海細胞生物所。所用培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的DMEM。細胞以每孔3×105/mL接種于96孔板，每孔取0.1mL；在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)；每天取4孔，做MTT檢測。以時間為橫軸，光吸收值為縱

9、軸繪制細胞生長曲線。 結(jié)果：Caco-2細胞在第1-7天呈增殖狀態(tài)，第8天開始細胞數(shù)目下降。提示有密度抑制，故較適合在第1-7天進行增殖、分化、蛋白表達等相關(guān)研究。 2.Caco-2單細胞層生長的觀察實驗方法：Caco-2細胞在95％空氣5％CO2的潮濕環(huán)境中，37℃條件下培養(yǎng)；3天傳代1次。細胞種植于單細胞層形成裝置(TranswellBicameralChambers，TBC)內(nèi)的聚碳酸酯膜上，同時按比例將細胞種植于

10、六孔板上做對照以觀察細胞長勢；于細胞種植后的不同天數(shù)分別在聚碳酸酯膜上層加入含有一定濃度酚紅的培養(yǎng)液，分別在加入后的2.5小時取聚碳酸酯膜上、下層液體0.5ml用分光光度計測定其酚紅含量；并在電鏡下觀察細胞連接情況。 實驗方法：細胞種植于聚碳酸酯膜上，同時按比例將細胞種植于六孔板上做對照以觀察細胞長勢；于細胞種植后的第二天，第三天，鏡下觀察細胞融合情況；細胞融合達80％左右，在聚碳酸酯膜上層加入含有酚紅和黃芪注射液(250

11、mg/L)的DMEM，分別在加入后的不同時間段，取聚碳酸酯膜下層液體0.5ml用分光光度計(波長為560nm)測定其酚紅含量；并在電鏡下觀察細胞連接情況。 結(jié)果：250mg/L濃度的黃芪注射液可降低Caco-2單細胞層的通透性，聚碳酸酯膜下層酚紅含量測定吸光度值分別在4小時、10小時、16小時、20小時、24小時較空白組低92.0％、69.5％、43.6％、49.5％、53.9％。與空白組比P＜0.05。電鏡下可見細胞絨毛面有微

12、絨毛，其所對應(yīng)的下面出現(xiàn)似粘附連接結(jié)構(gòu)；并在觀察視野中多處出現(xiàn)明顯的橋粒結(jié)構(gòu)?？瞻讓φ战M則無明顯的橋粒等細胞連接形成。 5.2免疫熒光法觀察黃芪注射液對細胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1表達影響的影響實驗方法：細胞接種于有蓋玻片的六孔板上，待細胞生長融合達80％左右添加250mg/L濃度的黃芪注射液繼續(xù)培養(yǎng)；24小時后用PBS漂洗，取出蓋玻片后，用95％酒精(或冷丙酮)固定，PBS漂洗；加入TritonX-100處理10min，PBS

13、漂洗；小牛血清白蛋白封閉，加入ZO-1抗體，4℃過夜，PBS漂洗后加入用FITC標(biāo)記的免疫熒光抗體1h，再用PBS漂洗，蒸餾水洗后用甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)果：250mg/L濃度的黃芪注射液組細胞膜附近ZO-1所在位置熒光信號強度與空白組相比未見明顯差異，提示250mg/L濃度的黃芪注射液對ZO-1蛋白的表達無明顯影響。 5.3WesternBlot法觀察黃芪注射液對細胞緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1表達的影響實驗方法

14、：細胞接種于六孔板上，待細胞生長融合達80％左右添加250mg/L濃度的黃芪注射液繼續(xù)培養(yǎng)；24h后用PBS漂洗，用含有Tris-Hcl(pH7.5)、EDTA(乙二胺四乙酸)、苯甲基磺酰氟(PMSF)Aprotinin(抑蛋白酶肽等的細胞裂解液裂解細胞；Bradford法對蛋白質(zhì)進行定量；聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；轉(zhuǎn)膜后進行免疫印跡；顯/影定影；凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。 結(jié)果：膠片上250mg/L濃度的黃芪注射液組灰度與空白相比未

15、見明顯不同，提示250mg/L濃度的黃芪注射液對ZO-1蛋白的表達無影響。 結(jié)論白術(shù)黃芪方可以治療三硝基苯磺酸所致動物潰瘍性結(jié)腸炎，減輕其炎癥程度，促進損傷粘膜的修復(fù)。本研究在細胞水平進一步研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)黃芪方有促進人腸上皮Caco-2細胞增殖的傾向、亦可促進Caco-2單細胞層緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1的表達，這可能是術(shù)黃芪方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶點和物質(zhì)基礎(chǔ)。 本實驗還對白術(shù)黃芪方的君藥白術(shù)、臣藥黃芪做了相關(guān)研究。發(fā)現(xiàn)