骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同微環(huán)境刺激應(yīng)答差異的比較分析.pdf

1、腫瘤的發(fā)生一直是困擾人類的醫(yī)學(xué)問題之一。長(zhǎng)期以來，人們對(duì)于腫瘤的起源存在著各種爭(zhēng)論。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腫瘤細(xì)胞來源于已分化細(xì)胞的去分化，并經(jīng)過發(fā)展和演進(jìn)，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在啟動(dòng)階段，分化成熟細(xì)胞受到致癌因素的刺激，基因發(fā)生突變；被啟動(dòng)的細(xì)胞若進(jìn)一步受到有絲分裂原的刺激，并經(jīng)過數(shù)次細(xì)胞增殖，將DNA損傷永久固定在細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入促進(jìn)階段；促進(jìn)階段的細(xì)胞若進(jìn)一步發(fā)生累加突變，則最終將演變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。但是已分化細(xì)胞生命周期短，其染色體的突變要固定下來

2、并傳給子代細(xì)胞的機(jī)會(huì)不大。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，并能自我復(fù)制和分化，正是由于其在體內(nèi)的長(zhǎng)期存在，使得基因突變更容易在這些細(xì)胞中積聚，同時(shí)通過自我復(fù)制使DNA損傷在細(xì)胞內(nèi)固定下來并傳給子代細(xì)胞，干細(xì)胞是腫瘤啟動(dòng)的天然靶細(xì)胞。 正常機(jī)體內(nèi)，干細(xì)胞的存在與組織損傷修復(fù)、細(xì)胞更新有關(guān)，是長(zhǎng)期進(jìn)化中形成的對(duì)人體的保護(hù)機(jī)制。研究表明，腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞具有許多相似性，腫瘤細(xì)胞很可能起源于不同分化階段的干細(xì)胞，腫

3、瘤內(nèi)有干細(xì)胞類群的存在。正常干細(xì)胞發(fā)揮功能時(shí)能夠根據(jù)機(jī)體的需要和遺傳約束力在增殖與分化之間達(dá)到完美的平衡，腫瘤細(xì)胞則無法在二者之間達(dá)成平衡，是脫離正常生長(zhǎng)調(diào)控系統(tǒng)，不受增殖調(diào)控的細(xì)胞。種種跡象表明，干細(xì)胞正常分化通路的阻斷和干擾可能是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要原因。然而，究竟是何原因使干細(xì)胞背離了正確的分化方向?腫瘤中的干細(xì)胞是否來源于正常的干細(xì)胞?是否存在有獨(dú)立的“腫瘤干細(xì)胞”?若能找出這些問題的答案，對(duì)于深入理解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，進(jìn)而制定有效

4、的腫瘤防治策略無疑具有十分重要的意義。本課題組前期工作利用肝損傷大鼠模型(2-AAF/CC1<,4>模型)的肝組織萃取物營(yíng)造的微環(huán)境，成功地將骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，并構(gòu)建了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)體系。被誘導(dǎo)細(xì)胞第7天表達(dá)幼稚肝細(xì)胞標(biāo)志GST-P和M<,2>-PK，第20天表達(dá)成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志Albumin。在另一組實(shí)驗(yàn)中，我們使用化學(xué)誘癌劑3’-甲基-奶油黃(3’-me-DAB)飼喂同一種動(dòng)物，卻誘發(fā)出肝癌。由此

5、推測(cè)，在2-AAF/CC1<,4>構(gòu)建的肝損傷大鼠模型中包含有適合干細(xì)胞正常分化的微環(huán)境，而在化學(xué)誘癌模型中則可能含有阻斷和干擾干細(xì)胞正常分化通路的因子。本研究擬通過兩種不同的肝組織萃取物(2-AAF/CC1<,4>肝損傷組織萃取物和3’-me-DAB化學(xué)誘癌肝組織萃取物)，分別營(yíng)造兩個(gè)不同的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，以觀察骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在不同微環(huán)境下的各種生物學(xué)變化特征，試圖揭示腫瘤發(fā)生與干細(xì)胞之間的內(nèi)在聯(lián)系。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.

6、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的獲取從SD雄性大鼠的雙側(cè)股骨和脛骨中用DMEM/F-12沖洗骨髓細(xì)胞，采用貼壁法分離出骨髓間質(zhì)細(xì)胞。采用換半液和一傳二的傳代培養(yǎng)方法，傳至第4代。 2.分化刺激物的制備及骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化構(gòu)建2-AAF/CCL<,4>急性肝損傷動(dòng)物模型，獲取動(dòng)物肝臟，提取肝組織萃取物。用此萃取物誘導(dǎo)第4代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，并分別收集7天、20天細(xì)胞。 3.分化干擾刺激物的制備及骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化的干擾實(shí)驗(yàn)構(gòu)建化學(xué)

7、誘癌動(dòng)物模型，選取第17周和第14周動(dòng)物，獲取動(dòng)物肝臟，提取肝組織萃取物。用此萃取物刺激第4代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，并分別收集7天、20天細(xì)胞。 4.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在不同微環(huán)境下生物學(xué)變化特征的觀察分析通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期、核型分析及分子表達(dá)譜諸方面的比較觀察，分析不同微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞正常分化途徑的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.在細(xì)胞形態(tài)上，分化組細(xì)胞在誘導(dǎo)第6天可見成纖維樣細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)突起縮短，12天后細(xì)胞主要呈簇狀緩慢生長(zhǎng)

8、，中央?yún)^(qū)域細(xì)胞突起完全消失呈圓形或近圓形上皮樣形態(tài)，外周細(xì)胞大部分細(xì)胞呈短梭形，15-18天，上皮樣細(xì)胞繼續(xù)增多，至20天時(shí)幾乎所有的細(xì)胞均呈上皮樣。分化干擾組細(xì)胞在刺激第7天長(zhǎng)梭形細(xì)胞胞體縮短，變寬，11天后中央?yún)^(qū)細(xì)胞可見少量細(xì)胞突起消失呈類圓形，但外周細(xì)胞仍保持短梭形，并保持這種形態(tài)至第20天。 2.在分子表達(dá)譜上，分化組細(xì)胞在誘導(dǎo)第7天出現(xiàn)幼稚肝細(xì)胞的標(biāo)志GST-P和M<,2>-PK，在誘導(dǎo)第20天出現(xiàn)成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志A

9、lbumin，分化干擾組細(xì)胞刺激第7天出現(xiàn)幼稚肝細(xì)胞的標(biāo)志GSTP和M<,2>PK，并持續(xù)表達(dá)至第20天，刺激第20天時(shí)未見成熟肝細(xì)胞標(biāo)志Abumin的表達(dá)。 3.細(xì)胞周期上，分化組細(xì)胞G<,0>/G<,1>91.4﹪～91.9﹪，S期5.8﹪～7.4﹪、G<,2>/M1．1﹪～2.3﹪，PI值8.1～8.6；與分化組比較，分化干擾組細(xì)胞G<,0>/G<,1>比例降低，S期、G<,2>/M期比例升高，PI值增高，分化干擾組細(xì)胞

10、增殖活性高。 4.在染色體核型分析上，分化組細(xì)胞染色體從數(shù)42，染色體范圍37～46，染色體少于40占總計(jì)數(shù)核型的15﹪，分化干擾組細(xì)胞染色體從數(shù)36～45，染色體范圍增寬，染色體少于40的百分率增加，高出分化組22﹪。 5.在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上，分化組細(xì)胞呈單層平鋪生長(zhǎng)，分化干擾組細(xì)胞在刺激第7天時(shí)亦呈單層平鋪生長(zhǎng)，但在刺激第20天時(shí)部分細(xì)胞呈多層重疊生長(zhǎng)，失去接觸抑制。 結(jié)論： 1.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在分化誘

11、導(dǎo)條件下，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出由最初的以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主逐漸演變?yōu)橐陨掀蛹?xì)胞為主的特征性變化，符合骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中展現(xiàn)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。而在分化干擾條件下，細(xì)胞則始終保持以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主的形態(tài)特征。由此可以判斷，微環(huán)境的差異己使骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分化進(jìn)程受到了影響。 2.在分化誘導(dǎo)條件下，骨髓問質(zhì)干細(xì)胞分別于誘導(dǎo)刺激的第7天表達(dá)幼稚肝細(xì)胞的分子標(biāo)志GST-P和M<,2>-PK，于第20天表達(dá)成熟肝細(xì)胞的分子標(biāo)志Albumin

12、，實(shí)現(xiàn)了向肝細(xì)胞的終末分化。在分化干擾實(shí)驗(yàn)中，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞僅在干擾刺激的第7天表達(dá)出幼稚肝細(xì)胞的分子標(biāo)志GST-P和M<,2>-PK，卻始終未能表達(dá)成熟肝細(xì)胞的分子標(biāo)志Albumin。實(shí)驗(yàn)表明，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化進(jìn)程已被阻滯在幼稚肝細(xì)胞階段。 3.在分化干擾條件下，處于S期和G<,2>/M期的細(xì)胞比例以及代表細(xì)胞增殖活性的PI值均高于分化誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞，表明不同的微環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞的增殖活性有重要影響。 4.

13、在分化干擾條件下，細(xì)胞染色體范圍19-84和非整倍體百分率46﹪明顯高于分化誘導(dǎo)狀態(tài)下的細(xì)胞(染色體范圍37-46，非整倍體百分率15﹪)，提示細(xì)胞染色體組型的穩(wěn)定性有所降低。 5.掃描電鏡結(jié)果顯示，干擾刺激第20天的細(xì)胞出現(xiàn)多層疊加生長(zhǎng)的現(xiàn)象，生長(zhǎng)方式與肝癌細(xì)胞株HepG2相似。提示，部分細(xì)胞的接觸抑制能力喪失。 6.經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在分化干擾條件下，無論在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期、染色體組型穩(wěn)定性、細(xì)胞超微