線粒體呼吸鏈與高氧肺損傷.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：高氧暴露所致線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷關系的研究
　　 實驗一：高氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ、Ⅴ表達的影響
　　 目的：研究高濃度氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ、Ⅴ動態(tài)表達的影響。探討高濃度氧暴露所導致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關系。
　　 方法：參照本研究室前期研究建立的早產(chǎn)鼠高氧肺損傷模型。早產(chǎn)新生SD大鼠生后

2、1d隨機分為空氣組、高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓氧艙中，氧濃度為85%；空氣組置于同一室常壓空氣中。兩組分別于高氧或空氣暴露后1、4、7、10和14d提取肺組織總RNA和蛋白，采取半定量逆轉錄聚合酶鏈反應測定Cytb、ATPase6，8 mRNA水平的動態(tài)表達；同時應用免疫組織化學方法檢測肺組織切片中Cytb蛋白分布和表達；應用Western blot檢測肺組織Cytb蛋白水平的動態(tài)表達。
　　 結果：(1)與空氣組相比，高氧暴

3、露1、4d Cytb mRNA含量及其表達顯著增強；7d后Cytb呈下降趨勢，其表達較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義。隨日齡變化高氧暴露后，肺組織Cytb免疫組織化學結果與Cytb mRNA表達相似。
　　 (2)Western blot結果顯示，與空氣組相比，高氧暴露1、4d肺組織Cytb蛋白表達增強但差異無統(tǒng)計學意義；7d后Cytb呈逐漸下降趨勢，其表達較空氣組減弱,但7、10d兩者相比差異無統(tǒng)計學意義，14d極顯著

4、減弱。
　　 (3)與空氣組相比，高氧暴露1d時ATPase6 mRNA表達顯著增強，4d雖仍增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義，7、10d時減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義，14d又出現(xiàn)極顯著增強；與空氣組相比，高氧暴露1、4d時ATPase8 mRNA表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義，7d后開始出現(xiàn)增強，7、14d時顯著增強，10d時雖仍增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：高氧暴露誘導線粒體呼吸鏈酶復合

5、體Ⅲ、Ⅴ表達水平的改變，可能導致線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)、“電子漏”產(chǎn)生ROS引起氧化應激和能量代謝障礙，這些變化共同參與高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程，因此，高濃度氧暴露所導致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。
　　 實驗二：高氧暴露對人肺腺癌A549細胞線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅳ表達的影響
　　 目的：研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的肺腺癌A549細胞線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅳ動態(tài)

6、表達的影響。探討高濃度氧暴露所導致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關系。
　　 方法：體外傳代培養(yǎng) A549細胞系，待其在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，隨機分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90%，CO2濃度為5%；空氣組仍置于含5% CO2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h 提取A549細胞總RNA,采取半定量逆轉錄聚合酶鏈反應測定ND1、COXⅠ mRN

7、A的表達。
　　 結果：(1)與同時間點空氣組相比，高氧暴露12h A549細胞ND1 mRNA的表達增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義；高氧組24h ND1 mRNA的表達顯著減弱；高氧組48h ND1 mRNA的表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (2)與同時間點空氣組相比，高氧暴露12h A549細胞COXⅠ mRNA的表達增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義；高氧暴露24、48h COXⅠ mRNA的表達顯著

8、增強，高氧暴露24h 以后COXⅠ mRNA的表達雖比空氣組增強，但呈下降趨勢。
　　 結論：高氧暴露誘導A549細胞線粒體呼吸鏈ND1、COXⅠ表達水平的改變，提示高氧暴露所致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。
　　 第二部分：高氧暴露對人肺腺癌A549細胞中硫氧還蛋白-2及細胞色素C表達的影響
　　 目的：研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的肺腺癌A549細胞中硫氧還蛋白-2

9、及細胞色素C表達的影響，探討Trx-2和Cytc的表達變化在高氧肺損傷發(fā)生發(fā)展中所起的作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體的保護作用。
　　 方法：體外傳代培養(yǎng) A549細胞系，待其在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，隨機分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90%，CO2濃度為5%；空氣組仍置于含5% CO2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h 提取A549細胞總RNA和

10、蛋白,采取半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定Trx-2、Cytc mRNA的表達；采用 Western blot檢測A549細胞Trx-2 蛋白的表達變化。
　　 結果：(1)與空氣組相比，高氧暴露12 h A549細胞Trx-2 mRNA表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義。24 h Trx-2 mRNA表達顯著增強；48 h后Trx-2 呈下降趨勢，其表達較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (

11、2)與空氣組相比，高氧暴露12h Cytc mRNA的表達顯著增強，24h Cytc mRNA的表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義，48h顯著減弱。
　　 (3)與空氣組相比，高氧暴露12h Trx-2 蛋白的表達顯著增強，24h Trx-2 蛋白的表達仍增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義，隨后逐漸減弱，至48h顯著減弱。
　　 結論：高濃度氧暴露誘導A549細胞中Trx-2和 Cytc 異常表達，提示Cytc 在高氧肺

12、損傷細胞凋亡發(fā)生過程中可能起重要作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體可能起重要的保護作用。
　　 第三部分：小分子干擾RNA抑制高氧暴露下A549細胞中Trx-2表達及其與肺細胞代謝和凋亡的關系
　　 目的：研究小分子干擾RNA抑制高氧暴露下人肺腺癌A549細胞中硫氧還蛋白-2表達及其與肺細胞代謝和凋亡的關系，探討高氧肺損傷的發(fā)病機制和防治措施。
　　 方法：體外傳代培養(yǎng)A549細胞系，待其在37℃ 5% CO2培

13、養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，將體外化學合成Trx-2 序列特異性的SiRNA通過Lipofectamine 2000轉染A549細胞。隨機分為Ⅰ空氣組，Ⅱ高氧組，Ⅲ小分子干擾RNA空氣組，Ⅳ小分子干擾RNA高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度為95%，CO2濃度為5%；空氣組仍置于含5% CO2培養(yǎng)箱中。四組分別于高氧或空氣暴露12、24、48h提取A549細胞總RNA和蛋白。采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應測定Trx-2、三磷

14、酸腺苷合成酶6，8及細胞色素CmRNA的表達,采用Western blot方法檢測Trx-2蛋白的表達,流式細胞術檢測高氧暴露和沉默Trx-2基因對A549細胞凋亡的影響。
　　 結果：(1)序列特異性SiRNA可顯著抑制Trx-2表達，Western blot檢測顯示Trx-2蛋白表達明顯下降，SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3三組中Trx-2蛋白表達均受到抑制，SiRNA-1組抑制效率最高（79.51%）。

15、>　　 (2)與空氣組相比，高氧組24h Trx-2和Cytc mRNA的表達顯著增高，但在48h Cytc mRNA的表達顯著降低。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h Trx-2mRNA的表達顯著減弱但在12、24h Cytc mRNA表達水平顯著升高。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組48h Trx-2 mRNA的表達顯著減弱，而24h Cytc mRNA表達顯著升高。
　　 (3)與空氣組

16、相比，高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達顯著增高，但在24、48h ATPase8 mRNA的表達顯著增高。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h ATPase6，8 mRNA的表達顯著減弱。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達顯著減弱，而12、48h ATPase8 mRNA表達顯著升高。
　　 (4)與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組24

17、h A549細胞凋亡百分數(shù)明顯增高，分別為（31.78±4.52）%VS（13.57±0.69）%；小分子干擾RNA高氧組24、48h A549細胞凋亡百分數(shù)明顯高于小分子干擾RNA空氣組，分別為（31.78±4.52）%VS（15.47±0.57）%，（38.51±4.08）%VS（25.84±1.01）%。
　　 結論：高氧暴露和沉默Trx-2基因導致A549細胞ATPase6，8表達異常和Cytc表達升高，細胞凋亡百分率顯