耐溫孕酮羥化酶產(chǎn)生菌的選育及其轉(zhuǎn)化條件的研究.pdf

1、微生物的11α-羥基化作用是甾體轉(zhuǎn)化中最重要的反應(yīng)之一，可以在甾體母核的C11α-位引入氧原子，具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)以及轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)，是甾體醫(yī)藥工業(yè)的關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)之一。黑根霉是生產(chǎn)11α-羥基-16α,17α-環(huán)氧孕酮的常用菌種，最適生長溫度為28℃，由于夏季溫度較高，需要用大量冷卻水來降低反應(yīng)溫度，造成了能源的大量耗費(fèi)，增加了產(chǎn)品的成本，本文從菌種和轉(zhuǎn)化條件方面對(duì)其生長與轉(zhuǎn)化溫度的提高進(jìn)行了研究。 首先對(duì)SW3.41進(jìn)

2、行了一系列溫度的考察，發(fā)現(xiàn)溫度升高至34℃時(shí)，羥化能力很低；為了提高菌株高溫下對(duì)底物的轉(zhuǎn)化能力，分別進(jìn)行了菌株的單菌分離和自然耐溫馴化研究，在高溫下為了進(jìn)一步提高菌株的轉(zhuǎn)化能力，又對(duì)菌株進(jìn)行了不同強(qiáng)度的60Co誘變，得到了一株在34℃下生長并且轉(zhuǎn)化率較高的菌株，編號(hào)為SW3.41-11-51。 對(duì)SW3.41-11-51菌株轉(zhuǎn)化16α,17α-環(huán)氧孕酮的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，通過單一素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(

3、g/L)：葡萄糖30，玉米漿30、KH2PO42。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：初始pH4.0、發(fā)酵溫度34℃，裝液量為30ml/250ml，轉(zhuǎn)速為150r/min，接種量為10％。為了提高菌體在高濃度下(12g/L)對(duì)底物16α,17α-環(huán)氧孕酮的轉(zhuǎn)化能力，對(duì)其轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行了一系列研究，分別考察了溶解氧、分散劑、超聲處理，外源電子受體和有機(jī)溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率都有不同程度的提高。其中氧載體正十二烷濃度為5％時(shí)，轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比提高幅

4、度為39％；分散劑Tween80濃度為3％時(shí)，轉(zhuǎn)化率與對(duì)照相比提高幅度為62.3％；超聲處理水懸液10min時(shí)轉(zhuǎn)化率提高幅度為38％；外源電子受體中維生素K3濃度為5mg/L時(shí)轉(zhuǎn)化率提高幅度為21.1％；有機(jī)溶劑/水兩相系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)化的初步研究中，確定了同時(shí)作為氧載體的正十二烷為有機(jī)相時(shí)，轉(zhuǎn)化效果較好，與對(duì)照相比提高幅度為60％。綜合以上各種優(yōu)化條件，以添加分散劑Tween80效果最好，轉(zhuǎn)化率可達(dá)43％，具有較好的工業(yè)前景。 本文首