應用ISSR技術探討冬青屬苦丁茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性和分類地位.pdf

1、“苦丁茶”是我國民間用作傳統(tǒng)代茶飲料或中草藥的一大類植物的統(tǒng)稱，具有較高的飲用和藥用價值，其中以冬青科冬青屬的“苦丁茶”最具影響。本研究利用ISSR分子標記技術系統(tǒng)地分析了以苦丁茶冬青(IlexkudingchaC.J.Tseng)為代表的冬青屬苦丁茶的遺傳多樣性，并探討了苦丁茶冬青與其近緣種五棱苦丁茶(I.pentagonaS.K.ChenY。X.Fenget.C.F.Liang)的親緣關系以及表型性狀介于二者之間的“中間類型”材料的

2、分類地位。研究結果如下： 1.通過對冬青屬苦丁茶ISSR反應各影響因子進行了系統(tǒng)地優(yōu)化，建立了本實驗ISSR分析最佳反應體系：10xbuffer2.5μl，DNA模板20ng，2.5mmol/LMgCl2，200μmol/LdNTPs，Taq酶1.0U，引物0.2μmol/L，用無菌超純水補足至25μl；PCR擴增程序為：94℃預變性5min，然后按94℃變性1min，48～56℃退火45s，72℃延伸2min，進行35個循環(huán)，

3、72℃后延伸5min，4℃冷卻取出。本研究均在上述最佳反應條件下進行，得到了穩(wěn)定性好、重復性高的擴增結果。 2.利用ISSR技術對冬青屬“苦丁茶”6個物種即苦丁茶冬青(I.kudingchaC.J.Tseng)、大葉冬青(I.latifoliaThunb.)、五棱苦丁茶(I.pentagonaS.K.ChenY.X.Fenget.C.F.Liang)、枸骨(I.cornutaLindl.)、華中枸骨(I.centrochines

4、isS.Y.Hu)、霍山冬青(I.huoshanensisY.H.He)以及表型性狀介于五棱苦丁茶與苦丁茶冬青之間的“中間類型”材料共51份種質(zhì)材料進行了分析。從80條ISSR引物中篩選出18條有效引物，共檢測到351個位點，其中多態(tài)位點318個，多態(tài)位點百分率(PPB)為90.6％。UPGMA法聚類分析結果表明：ISSR技術可以將供試的冬青屬6個物種和一類“中間類型”材料明顯區(qū)分開來，各物種之間遺傳差異較大，遺傳距離在0.0771～0

5、.7631之間，平均遺傳距離為0.4152?？喽〔瓒嗪臀謇饪喽〔璺謩e單獨聚類，從分子水平支持五棱苦丁茶作為新種的觀點，與形態(tài)學的分類結果一致。 3.利用ISSR技術對57份苦丁茶冬青種質(zhì)材料、13份五棱苦丁茶種質(zhì)材料以及介于二者之間的6份中間類型種質(zhì)材料進行了分析。從80條ISSR引物中篩選出20條有效引物，共檢測到346個位點，其中多態(tài)性位點304個，多態(tài)位點百分率(PPB)為87.8％?？喽〔瓒喾N質(zhì)材料的遺傳多樣性分析表

6、明：在物種水平上，多態(tài)位點百分率(PPB)=85.6％，有效等位基因數(shù)(Ne)=1.3657，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.3252，Shannon信息多樣性指數(shù)(Ⅰ)為I=0.3531:在居群水平上，PPB=77.9％，Ne=1.1929，H=0.1260，I=0.1795。基于Nei’s遺傳多樣性分析得出的居群間遺傳多樣性分化系數(shù)(Gst)=0.4184，基因流(Nm)為0.6950＜1。結果表明：苦丁茶冬青居群間的基因交流有

7、限，居群的變異主要發(fā)生在居群內(nèi)(58.16％)，居群間變異小于居群內(nèi)。聚類分析結果表明：苦丁茶冬青不同地域起源的種質(zhì)材料在聚類圖中明顯分為海南、廣東、廣西三大居群，供試材料的遺傳距離在0.2689～0.5378之間。在聚類圖中，廣東居群先與廣西居群聚在一起，然后才與海南居群聚在一起，也表明了不同地理起源與材料間的親緣關系遠近是一致的。同一起源地域內(nèi)的種質(zhì)材料遺傳距離較小，不同起源地域的種質(zhì)材料遺傳距離較大，特別是起源于海南島的苦丁茶冬青

8、種質(zhì)材料與起源于大陸各區(qū)域的苦丁茶冬青種質(zhì)材料遺傳差異較大，故作者認為可將其劃分為苦丁茶冬青的一個生態(tài)型。 4.中間類型材料在聚類圖中單獨歸聚為與五棱苦丁茶種質(zhì)材料平行的一分支，二者再聚合，形成與苦丁茶冬青平行的一支?；谛螒B(tài)特征和分子標記研究均表明這類中間類型材料在分類學上無論是歸類于苦丁茶冬青或歸類于五棱苦丁茶均是不合適的。野外考察發(fā)現(xiàn)這些材料的原產(chǎn)地同時生長著苦丁茶冬青和五棱苦丁茶，且這兩個種都為異花授粉植物，花期又大致相