視黃醇對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞體外生物學(xué)特性的影響.pdf

1、視黃醇及其代謝產(chǎn)物是雄性動(dòng)物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生所必需的物質(zhì)。支持細(xì)胞是睪丸內(nèi)視黃醇作用的靶細(xì)胞，為生精細(xì)胞發(fā)育和成熟提供特有的微環(huán)境。本試驗(yàn)以分離自3-5周齡仔豬睪丸的支持細(xì)胞為材料，采用RT-PCR、CCK-8、ELISA檢測(cè)支持細(xì)胞內(nèi)增殖和凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞因子的表達(dá)，分析視黃醇對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞增殖、凋亡和表達(dá)細(xì)胞因子的影響，獲得如下結(jié)果:
　　1.仔豬支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　經(jīng)比較3組酶消化法所獲得細(xì)胞數(shù)量、細(xì)

2、胞活率和GATA-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，先以0.25％膠原酶Ⅳ和0.1％透明質(zhì)酸酶，37℃消化60 min，再以0.25％胰酶和0.1％DNaseⅠ，37℃消化20 min，有利于支持細(xì)胞的富集。于貼壁不同時(shí)間收集細(xì)胞，分析懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞中GATA-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，支持細(xì)胞在2h內(nèi)不貼壁，貼壁時(shí)間主要分布在3～5 h。采用差異貼壁和低滲處理后純化細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則，胞體寬大，細(xì)胞核呈卵圓或不規(guī)則形;GAT

3、A4染色呈陽(yáng)性，堿性磷酸酶染色呈陰性;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后細(xì)胞表達(dá)支持細(xì)胞標(biāo)記GATA4、SOX9、INHB，不表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CYP17、3β-HSD和管周細(xì)胞標(biāo)記α-SMA，符合支持細(xì)胞的驀本特征;經(jīng)ELISA檢測(cè)顯示，本試驗(yàn)所分離支持細(xì)胞表達(dá)GDNF、LIF、CSF-1、FGF2、EGF，而SCF未檢出。
　　2.視黃醇對(duì)支持細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　分別在培養(yǎng)基中添加0.005μmol/L、0.025μm

4、ol/L、0.125μmol/L、0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L視黃醇，短期培養(yǎng)(24h)和長(zhǎng)期培養(yǎng)(3d)后，經(jīng)CCK-8檢測(cè)支持細(xì)胞活性，結(jié)果如下:培養(yǎng)24h，視黃醇濃度低于5μmol/L，對(duì)支持細(xì)胞的活性沒(méi)有顯著影響，而濃度達(dá)到5μmol/L顯著抑制支持細(xì)胞活性，表明5μmol/L及以上濃度的視黃醇對(duì)支持細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng);培養(yǎng)3d，視黃醇濃度低于為0.0

5、05μmol/L和0.025μmol/L時(shí)對(duì)支持細(xì)胞活性無(wú)顯著影響，視黃醇濃度為0.125μmol/L和0.625μmol/L時(shí)顯著抑制支持細(xì)胞活性(P＜0.05)，濃度達(dá)到1.25μmol/L時(shí)表現(xiàn)極顯著抑制(P＜0.01)。短期培養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)結(jié)果顯示，視黃醇的作用具有時(shí)效性和劑量依賴性。
　　實(shí)驗(yàn)選取1.25μmol/L作為視黃醇的試驗(yàn)濃度，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)分析視黃醇對(duì)細(xì)胞增殖(PCNA、C-MYC和BCL-2)和凋亡相關(guān)

6、基因(CASP3和BAX)表達(dá)的影響，結(jié)果顯示:視黃醇組增殖相關(guān)基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明視黃醇通過(guò)抑制支持細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)凋亡相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而抑制支持細(xì)胞增殖。
　　3.視黃醇對(duì)支持細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響
　　在培養(yǎng)基中添加1.25μmol/L視黃醇，應(yīng)用RT-PCR分析和ELISA檢測(cè)分析視黃醇對(duì)支持細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響，RT-PCR分析顯示，視黃醇顯著抑制支