不同洗滌離心力對臍血間充質干細胞純化的影響.pdf

1、目的：由于間充質干細胞(MSCs)對于人類疾病治療具有潛在的、可預期的重大影響，近年來，許多學者致力于應用MSCs治療疾病的基礎與臨床研究，其中，以臍血間充質干細胞(UCB-MSCs)的研究為主導。目前，UCB-MSCs已被成功誘導分化為多種組織細胞，不少學者也對UCB-MSCs的分離純化技術進行了探索，對其培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件進行了諸多的改良和優(yōu)化，但在不同洗滌離心力對UCB-MSCs純化的影響方面卻鮮見報道。筆者在進行UCB-MSCs

2、培養(yǎng)時，反復使用大部分學者采用[1]的1500r/min離心10min(r=15cm，相對離心場RCF=378g)洗滌技術，始終未能獲得滿意的細胞貼壁及生長結果，分析認為是由于該洗滌方法所得到的細胞純度不高所致。由于不同離心力洗滌對于干細胞純化的影響舉足輕重，故有必要對其進行深入的研究。本實驗在其它實驗條件不變的基礎上，首先將臍血離心并有效分層，然后使用不同離心力洗滌，觀察對比不同洗滌離心力對UCB-MSCs純化的影響，以期尋找出更有利

3、于干細胞純化的適宜洗滌離心技術，為UCB-MSCs培養(yǎng)提供更好的基礎條件。
　　方法：選擇滿足UCB-MSCs采集適應癥的孕婦8名，無菌采集臍血約40ml。首先以1:1比例用0.9％生理鹽水將臍血稀釋，然后按照1:1比例將稀釋后臍血緩緩加入淋巴細胞分離液(1.077g/ml)中，2000r/min離心20min(671 g)，將臍血有效分層。輕輕吸取中間白膜層約30ml，添加0.9％生理鹽水至50ml后混勻，將其平均分為5份，每份

4、10ml，分別以1500r/min離心10min(378g)、1300r/min離心10min(284g)、1200r/min離心10min(242g)、1000 r/min離心10min(168g)、800 r/min離心10min(107g)，洗滌后均棄上清液，余細胞沉淀約0.5ml，加入L-DMEM-10％胎牛血清-慶大霉素培養(yǎng)基至10ml，混勻后分別接種于T25培養(yǎng)瓶，倒置相差顯微鏡下觀察(放大倍數(shù)10×20)，選取混雜物質數(shù)量

5、居中的視野，對比每組混雜物質的差異并行圖像采集，使用多項目自動血球分析裝置(XT-1800i)分析每份細胞懸液，記錄其單個核細胞(MNCs)密度(109/L)、紅細胞(RBCs)密度(109/L)、血小板(PLT)密度(109/L)、MNCs率(％)，使用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，并繪制曲線圖。另外，移液槍吸取每份細胞懸液一滴涂片，行瑞氏染色，于油鏡下觀察雜質情況并采集圖像。在細胞接種后第7天棄全部培養(yǎng)液，倒置相差顯微鏡

6、下觀察，于各接種瓶中選取貼壁細胞數(shù)量居中的的視野5個，分別計數(shù)后行方差分析，并觀察對比梭狀細胞數(shù)。細胞接種后第14天，分別觀察每瓶細胞生長情況，選取生長情況居中的視野采集圖像。
　　結果：1、比較不同離心力洗滌后接種當時在倒置相差顯微鏡下觀察到的情況，1500r/min洗滌、1300r/min洗滌接種瓶中除大量細胞外，可見大量混雜物質，而1200r/min洗滌、1000 r/min洗滌、800r/min洗滌接種瓶中除大量細胞外，混

7、雜物質明顯低于前兩者，800r/min洗滌接種瓶尤為顯著，將細胞懸液涂片行瑞氏染色后于油鏡下觀察(放大倍數(shù)10×1000)，結果同倒置相差顯微鏡下觀察。2、將不同離心力洗滌后所得的MNCs密度(109/L)、RBCs密度(109/L)、PLT密度(109/L)、MNCs率(％)繪制成曲線圖，并行方差分析，其中MNCs密度(109/L)隨洗滌離心力降低有降低的趨勢、MNCs率(％)隨洗滌離心力降低有升高的趨勢，但二者的差別均不具有統(tǒng)計學意

8、義(P>0.05)，PLT密度(109/L)、RBCs密度(109/L)隨洗滌離心力降低有降低的趨勢，其數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3、細胞接種后第7天，于各接種瓶中選取貼壁細胞數(shù)量居中的的視野5個，分別計數(shù)后行方差分析，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，觀察對比梭狀細胞數(shù)，800r/min洗滌的各接種瓶中，梭狀細胞數(shù)≥5個/視野的約有5-8個視野，1200r/min洗滌、1000 r/min洗滌的各接種瓶中約有1-3個

9、，1500r/min洗滌、1300r/min洗滌的各接種瓶中無滿足條件的視野。4、接種14天后倒置相差顯微鏡下觀察，800r/min洗滌的接種瓶中細胞生長情況相對最佳，2-5個視野下可見梭狀細胞融合抱團生長(抱團細胞數(shù)≥7個/視野)，其余接種瓶從未見抱團生長情況，且細胞趨于死亡。
　　結論：1.在使用淋巴細胞分離液(1.077g/ml)進行密度梯度離心法分離提純UCB-MSCs時，目前普遍采用的1500r/min離心10min(r

10、=15cm，相對離心場RCF=378g)洗滌法所獲得的細胞純度不高，其中含大量混雜物質，不利于UCB-MSCs貼壁、生長和分化，低離心力洗滌可使UCB-MSCs純度大大提高，利于UCB-MSCs貼壁和生長、分化，800r/min離心10min洗滌效果最佳；2、在使用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心法分離提純UCB-MSCs時，RBCs殘余量對UCB-MSCs貼壁的影響遠遠低于PLT殘余量對其的影響，PLT殘余量可能才是影響UCB-MSCs