黃孢原毛平革菌木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因（lipC）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究.pdf

1、黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)屬于白腐擔(dān)子真菌，是研究木質(zhì)素生物降解的模式生物，因其具有出色的降解木質(zhì)素的能力，而且對(duì)環(huán)境中的有毒物質(zhì)、爆炸污染物等也有降解作用，因此P.chrysosporium在造紙工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面具有重要的應(yīng)用前景。研究表明，P. chrysosporium降解木質(zhì)素是由眾多的胞外過(guò)氧化物酶參與的復(fù)雜的生物過(guò)程，LiP和MnP是主要的2類過(guò)氧化物酶。Northernbl

2、ot和RT-PCR分析表明。這2類酶均受到C、N、O等因素的調(diào)節(jié)，暗示在其基因的5'-端可能存在順式調(diào)控元件與反式作用因子相互作用調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。已有的研究表明，在lipC 5'-端存在2個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合元件--PBE1和PBE2。本研究在這一工作的基礎(chǔ)上做了如下兩方面的研究工作。 首先，分別以PBE1、PBE2和PBE1+PBE2為釣餌，利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)低氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d P. chrysosporium的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩

3、選，研究結(jié)果表明：以PBE1為釣餌篩選到9個(gè)cDNA序列；以PBE2為釣餌篩選到的6個(gè)序列：以PBE1+PBE2為釣餌所篩選到10個(gè)序列。對(duì)這25個(gè)cDNA序列進(jìn)行了較系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，只有4個(gè)序列編碼的蛋白質(zhì)能定位在細(xì)胞核中，編號(hào)是PBE1-A20.3、PBE1-A12.4、PBE2-A5.1和PBE1-2-A27.1，因此對(duì)這4個(gè)克隆進(jìn)行了較深入的分析。序列分析表明，PBE1-A20.3編碼一種未知蛋白；PBE2-A1

4、2.4編碼的蛋白質(zhì)與多功能蛋白14-3-3有較高的同源性，而14-3-3蛋白參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、基因轉(zhuǎn)錄等眾多重要生命活動(dòng)過(guò)程，14-3-3蛋白主要以蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方式發(fā)揮功能。在動(dòng)物、植物以及酵母中，14-3-3還可以與十字型DNA結(jié)合調(diào)節(jié)DNA復(fù)制。功能位點(diǎn)分析表明，PBE2-A5.1編碼蛋白質(zhì)含有1個(gè)ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和1個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，很多調(diào)控蛋白質(zhì)中含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，包括CCATT盒及增

5、強(qiáng)子結(jié)合蛋白、cAMP應(yīng)答元件(CRE)結(jié)合蛋白、酵母一般調(diào)控蛋白GCN4、octamer-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子2(Oct-2/OTF-2)等。PBE1-2-A27-1編碼的蛋白質(zhì)含HIT(histidine triad)結(jié)構(gòu)域，含該結(jié)構(gòu)的蛋白可以與核酸結(jié)合。 為進(jìn)一步鑒定酵母單雜交篩選到的陽(yáng)性克隆與順式元件的結(jié)合作用，利用pET-28a載體對(duì)篩選到的14-3-3蛋白編碼序列進(jìn)行原核生物表達(dá)，SDS-PAGE分析表明，14-3-3蛋白在

6、Escherichia.coli BL21中以部分包涵體和部分可溶性形式存在，分子量為33 kD。通過(guò)Ni柱純化得到E.coli中可溶表達(dá)的14-3-3蛋白，并用透析和PEG20000濃縮該蛋白用于體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(GMSA)。表達(dá)的14-3-3蛋白與<'32>p標(biāo)記的PBE1+PBE2探針混合后，經(jīng)低離子強(qiáng)度聚丙烯酰胺凝膠電泳、放射自顯影表明，14-3-3蛋白電泳有明顯的延遲現(xiàn)象，當(dāng)加入40倍的冷探針后，延遲現(xiàn)象減弱，加大14-3-3蛋白

7、量后，延遲現(xiàn)象增強(qiáng)，表明14-3-3蛋白可以與該探針特異結(jié)合。 在上述研究工作基礎(chǔ)上，以14-3-3蛋白為釣餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選P. chrysosporium 3d cDNA文庫(kù)，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培養(yǎng)基平板上共獲得了約601個(gè)單克隆。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，只有少部分克隆可激活3個(gè)報(bào)告基因。分離自這些克隆中的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用HaeⅢ和Sau3AI限制酶切分析可將其分為9類。序列測(cè)定和

8、同源分析結(jié)果表明，測(cè)定的6個(gè)序列均具有多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，也是14-3-3蛋白潛在的結(jié)合位點(diǎn)。其中有2個(gè)序列具有WD結(jié)構(gòu)域，表明14-3-3蛋白在P.chrysosporium中也是一個(gè)多功能蛋白質(zhì)。Y2H147與轉(zhuǎn)錄因子有一定相似性。高級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，P. chrysosporium中的14-3-3蛋白與其它物種中的一樣，含有9個(gè)Helix結(jié)構(gòu)，且可以形成杯狀的同源二聚體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì).蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，14-3-3蛋白可以與Y2H