血紅素氧化酶-1在心臟干細胞治療急性心肌梗死中的免疫機制研究.pdf

1、研究背景:盡管臨床介入治療，藥物治療及預防策略的不斷進展，心臟病仍是全球?qū)е滤劳龅淖钗ｋU疾病。其中缺血性心臟病是導致心衰死亡的主要原因。干細胞移植能夠從結(jié)構(gòu)上修復受損的心臟，從而恢復心臟功能，預防或逆轉(zhuǎn)心衰的發(fā)生，為急性心肌梗死(AMI)的治療帶來新的希望。盡管許多研究表明(1;2)，骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)在AMI中能促進心肌的修復，改善心功能。但其為轉(zhuǎn)分化，融合或旁分泌效應，機制尚不明確。目前更多的研究集中在識別心臟本身的干細胞

2、(CSCs)和促使它們增殖和遷移的因子，但自體CSCs由于來源有限，取材和擴增困難及自身條件的限制不能適應心肌梗死急診治療的要求。同種異體心臟干細胞移植能解決這一難題，但其存在的最大障礙是移植排斥反應，移植可能誘導的炎癥反應受到極大的關注，炎癥因子能夠上調(diào)主要組織相容性復合體(MHC)在移植細胞的表達，導致細胞更易受到移植排斥。血紅素氧化酶-1(HO-1)具有抗炎及抗凋亡的特性，研究表明其在同種異體器官移植中具有重要的保護作用，已有研究

3、表明HO-1在MSCs的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用(3;4)。本研究假設HO-1在同種異體心臟干細胞移植后的免疫網(wǎng)絡中起著關鍵作用，通過調(diào)節(jié)MHC的表達，減低免疫排斥反應，增加移植細胞的存活，從而達到改善心功能的目的。
　　 第一部分心臟干細胞表面主要組織相容性復合體表達的研究
　　 目的:主要組織相容性復合體是指編碼主要組織相容性抗原的一組緊密連鎖的基因群，與特異性免疫應答密切相關。MHC-Ⅰ類分子及MHC-Ⅱ類分子在機體

4、識別自身，抗原處理、提呈通路在調(diào)控CD4+T細胞激活及特異性應答的過程中發(fā)揮重要的作用，T細胞的功能在很大程度上取決于MHC-Ⅱ類分子的表達水平，但研究表明干細胞表達低水平的MHC-Ⅰ類分子及不表達MHC-Ⅱ類分子。本研究明確CSCs及MSCs表面MHC-Ⅰ類分子及Ⅱ類分子的表達。資料與方法:CSCs來源于C57BL/6小鼠的心臟，心臟組織經(jīng)酶消化貼壁培養(yǎng)，游離出心臟成纖維細胞及圓形發(fā)亮的干細胞，經(jīng)過干細胞標志Ckit(CD117)磁珠

5、篩選獲得Ckit+CSC。同時獲得小鼠四肢骨，經(jīng)研磨，過濾，全骨髓法培養(yǎng)MSCs，傳代2次后，經(jīng)過bio-CD45磁珠分選，獲得CD45陰性的MSC。脾細胞通過研磨脾臟，F(xiàn)icoll-paque密度梯度離心法獲得脾細胞。通過流式細胞儀分析CSCs及MSCs的表面標志，real-timeRT-PCR及WesternBlot從mRNA及蛋白水平觀察CSCs及MSCs表面MHCⅠ類及Ⅱ類分子的表達水平。結(jié)果:流式細胞檢測表明CSC及MSC均為

6、Sca1+細胞群。RT-PCR從mRNA水平證實CSC為GATA4陽性的細胞，跟脾細胞相比，CSC及MSC均低水平表達MHC-Ⅰ類分子，幾乎不表達MHC-Ⅱ類分子。CSC與MSC相比MHC-Ⅰ類分子表達水平更低。結(jié)論:經(jīng)兩步法培養(yǎng)獲得的CSC為Ckit+/Sca1+細胞群，且高表達GATA4。體外培養(yǎng)中MSC及CSC均表達低水平的MHCⅠ類分子，缺乏MHC-Ⅱ類分子，表現(xiàn)為較低的免疫源性。
　　 第二部分炎癥環(huán)境下心臟干細胞表面

7、主要組織相容性復合體表達的改變
　　 目的:干細胞移植成為缺血性心臟病的潛在治療方法，細胞移植誘導的炎癥反應正受到越來越多的關注，炎癥因子能夠上調(diào)主要組織相容性復合體的表達，從而使移植細胞更易發(fā)生移植排斥。本研究觀察炎癥因子干擾素-γ對心臟干細胞表面MHC-Ⅰ類及Ⅱ類分子表達的影響及其調(diào)控機制。資料與方法:通過從C57BL/6小鼠的心臟，骨髓分離、培養(yǎng)獲取心臟干細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞，干擾素-γ(25ng/ml)治療后24小時，

8、收集RNA及蛋白，從mRNA及蛋白水平觀察MHCⅠ類分子，Tapsin，MHC-Ⅱ類分子及其主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ類反式激活蛋白(classⅡtrans-activator，CⅡTA)的改變。為證實CⅡTA在干擾素-γ誘導MHC表達中的作用，獲取CⅡTA基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟，培養(yǎng)心臟干細胞，RT-PCR證實其不表達MHC-Ⅱ，并且干擾素-γ治療后不能誘導MHC-Ⅱ的表達，但CⅡTA基因敲除對MHC-Ⅰ類分子的表達沒有顯著影響。建立小鼠急

9、性心肌梗死模型，觀察急性心肌梗死后1天，3天，5天干擾素-γ的變化，直接經(jīng)心肌注射心臟干細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞觀察自體移植及同種異體移植在心肌梗死區(qū)所誘導的干擾素-γ，IL-10的水平變化，同時通過GFP表達水平比較MSC及CSC在移植區(qū)的存活。結(jié)果:RT-PCR證實IFN-γ治療后MSCsmRNA水平H2Kb，H2Db，Tapasin分別增加了6.73，10.3及4.67倍，MHC-Ⅱ表達增加了21.24倍，CⅡTA增加了147.37

10、倍。CSCsH2Kb，H2Db，Tapsin分別增加了5.54，3.53及6.34倍。MHC-Ⅱ表達增加了104.35倍，CⅡTA增加了222.65倍。在CⅡTA基因敲除的CSC，干擾素-γ治療后MHC-Ⅱ類分子的表達沒有明顯變化。WesternBlot及流式細胞檢測亦從蛋白水平證實干擾素-γ刺激增加了MHC-Ⅰ類分子及MHC-Ⅱ類分子的表達。小鼠急性心肌梗死模型證實心肌梗死后及自體干細胞移植干擾素-γ水平?jīng)]有明顯變化，但同種異體心臟干

11、細胞移植明顯增加了干擾素-γ的水平，降低了CSCs在缺血梗死區(qū)的存活率。
　　 結(jié)論:IFN-γ能增加MSC及CSCMHC-Ⅰ類分子及MHC-Ⅱ類分子的表達，通過CⅡTA從轉(zhuǎn)錄水平精細調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ的表達。同種異體心臟干細胞移植后能誘導炎癥反應，從而加重免疫排斥。
　　 第三部分:血紅素氧化酶-1通過CⅡTA精細調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ的表達
　　 目的:血紅素氧化酶-1(HO-1)是細胞的一種內(nèi)源性保護蛋白，其水平在應激

12、情況下（包括氧化應激、炎癥因子）會上調(diào)，具有抗缺血再灌注損傷和低氧損傷的功能，在缺血環(huán)境中具有細胞保護活性。本研究探討HO-1在同種異體心臟干細胞移植免疫排斥中的保護作用。
　　 資料及方法:為了研究HO-1對心臟干細胞MHC表達的影響，通過慢病毒包裝HO-1質(zhì)粒獲得過表達HO-1的CSCs及siRNA干擾技術下調(diào)CSCs的HO-1水平，并且模擬移植后的炎癥環(huán)境，利用干擾素-γ（IFN-γ，25ng/ml）刺激CSCs，Lent

13、i-HO-1-CSCs及siRNA-HO-1-CSCs24小時，通過RT-PCR從mRNA水平評價HO-1在正常環(huán)境下及炎癥環(huán)境下對MHC-Ⅰ類分子及MHC-Ⅱ類分子的影響及其調(diào)節(jié)機制。為了研究HO-1對IFN-γ調(diào)節(jié)MHC-Ⅱ表達機制的影響，通過RT-PCR從mRNA水平證實CⅡTA表達的改變，明確HO-1對MHC-Ⅱ類分子在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。
　　 實驗結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建了HO-1高表達的CSCs及siRNA干擾技術下調(diào)

14、HO-1表達的CSCs。RT-PCR及WesternBlot從mRNA及蛋白水平證實了HO-1的轉(zhuǎn)染效率。WesternBlot從蛋白水平證實過表達HO-1的CSCs，其HO-1表達較正常CSCs增加了8.35倍，siRNA-HO-1-CSCs其HO-1水平較正常下調(diào)了0.71倍。進一步RT-PCR從mRNA水平證實HO-1修飾的CSCsH2Kb,H2Db，Tapsin，MHC-Ⅱ分別下降了-2.30，-2.21，-3.35及-6.77

15、倍，siRNA靶向敲除的CSCsH2Kb，H2Db，Tapasin，MHC-Ⅱ分別增加了1.13，2.14，3.4及2.99倍。在同樣IFN-γ刺激條件下，HO-1-CSC比CSCH2Kb，H2Db，Tapasin，MHC-Ⅱ分別下降了-3.48，-3.79，-4.88，-13.78倍。繼而RT-PCR檢測證實過表達HO-1增加了CⅡTA水平，下調(diào)HO-1在CSC的表達隨之CⅡTA的水平亦下降。結(jié)論:HO-1能影響正常及炎癥環(huán)境下CSC