人類乙型肝炎病毒聚合酶反式調(diào)節(jié)新基因HBVDNAPTP1的克隆表達(dá)與部分功能研究.pdf

1、發(fā)現(xiàn)一種新基因，將其編碼的新蛋白結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能，與生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)之間的相互關(guān)系，以及表達(dá)調(diào)控機(jī)制闡明，是目前分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中最具有挑戰(zhàn)性的工作。及于我們的工作，首先，以基因的克隆表達(dá)為主要目的的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，是深入研究新基因功能的基礎(chǔ)工作。其次，由于蛋白之間的相互作用以及基因表達(dá)對(duì)靶細(xì)胞基因表達(dá)譜的反式調(diào)節(jié)作用是新基因發(fā)揮生物學(xué)功能的重要途徑，因此現(xiàn)階段主要工作側(cè)重于新基因編碼蛋白的相互作用蛋白以及差異表達(dá)基

2、因的篩選。為此本文做了以下五方面工作。 1.提取HepG2細(xì)胞mRNA，利用RT-PCR方法在HBVDNAPTP1基因的兩端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，獲得了444bp的目的基因片段，連接至pGEM-T載體，測(cè)序正確后插入至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，0.5mM/mlIPTG、30℃誘導(dǎo)5hr獲得了帶有組氨酸標(biāo)簽的重組融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)，采用組氨酸親和層析方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，每升細(xì)菌培

3、養(yǎng)液中可獲得2.24mg的純化蛋白。 2.利用相同方法將引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的HBVDNAPTP1基因片段插入至綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C1中，分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞與COS7細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48-72hr內(nèi)細(xì)胞漿出現(xiàn)明顯的綠色熒光信號(hào)，提示HBVDNAPTP1主要定位于胞漿內(nèi)，也說明該蛋白主要在胞漿中行使其生物學(xué)功能。經(jīng)Unigene數(shù)據(jù)庫搜索分析發(fā)現(xiàn)，HBVDNAPTP1基因定位于人類

4、9號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)2帶31亞帶，屬于第10開放讀碼框架，可在多種組織中以極低水平表達(dá)，但在腦垂體腺、扁桃體、舌、胸腺、氣管與臍帶中未見表達(dá)。 3.利用ExPASyproteomicsserver對(duì)HBVDNAPTP1進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)分析。HBVDNAPTP1相對(duì)分子量為15991.7，理論pI為8.17，不同條件下的消光系數(shù)為8730M-1cm-1或8250M-1cm-1(280nm)，在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中的半

5、壽期為30hr，并且無卷曲螺旋區(qū)域，但具有6個(gè)疏水區(qū)；無特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別有2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)與3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，不具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽，定位于細(xì)胞漿中。 4.將引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的HBVDNAPTP1基因片段插入至酵母細(xì)胞表達(dá)載體pGBKT7中，轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株并獲得表達(dá)，與含有肝細(xì)胞文庫質(zhì)粒的Y187酵母菌株配合，進(jìn)行酵母雙雜交篩選獲得了與HBVDNAPTP

6、1具有相互作用的已知功能蛋白4種，包括成對(duì)免疫球蛋白樣2型α受體、酶原顆粒蛋白16、羧酸脂酶1、β轉(zhuǎn)導(dǎo)素樣蛋白2。結(jié)果提示HBVDNAPTP1可能參與肝細(xì)胞增殖分化、信息傳遞以及生長(zhǎng)代謝。此外還篩選得到一個(gè)新基因，命名為乙型肝炎病毒聚合酶反式調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合蛋白(GenBankAccession：DQ414819)。 5.構(gòu)建pcDNA3.1/myc-His(-)A-HBVDNAPTP1真核表達(dá)重組質(zhì)粒，與空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)

7、胞并獲得表達(dá)，兩者互為平行對(duì)照，提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞mRNA，分別進(jìn)行正向、反向抑制性消減雜交，篩選獲得了8條已知的反式上調(diào)基因，包括細(xì)胞分裂周期素26、脯氨酰-4羥化酶αⅠ亞基、酪蛋白激酶2β亞基等；16條已知的反式下調(diào)基因，包括CDC42結(jié)合蛋白4、熱休克蛋白40同系物C亞族成員8、ATP合酶F0亞基6、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β2亞基、Na+/K+-ATP酶β3亞基、NADH脫氫酶5亞基、真核翻譯起始因子312亞基、依賴DNA的RNA聚合