十全大補(bǔ)湯對(duì)阿爾茨海默病中小膠質(zhì)細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)在阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)變性病炎性發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到關(guān)注。MG的活化具有雙重作用。一方面，它可以產(chǎn)生多種前炎性因子，具有神經(jīng)毒性；另一方面，它又可以產(chǎn)生一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，而更重要的是，其對(duì)β淀粉樣蛋白(Aβ)具有吞噬能力。目前，多數(shù)研究者立足于通過抑制MG的活化來減輕炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)損傷。在AD中，非選擇性地阻斷MG的功能雖然可以減弱局部的炎性反應(yīng)，但同時(shí)也抑制了MG對(duì)Aβ的吞噬作用，可能使更多的Aβ聚集沉積

2、而最終導(dǎo)致病情惡化。因此，如何有效地調(diào)控MG的功能，既提高其特異性吞噬Aβ的能力，又能盡量抑制其產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和NO等，是應(yīng)用MG作為AD的一種治療手段的根本方向。 近年來，有關(guān)骨髓干細(xì)胞(BMSC)來源MG的研究成為熱點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí)，BMSC能夠透過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并分化為功能性MG。這種骨髓來源的MG(BMDM)更易被吸引到神經(jīng)病變區(qū)域。在AD鼠模型中老年斑周圍的MG中90％以上是骨髓源性的，這種BMDM通過吞噬A

3、β而起到延緩疾病進(jìn)展的作用。而且，BMDM與固有MG相比是更有效的抗原遞呈細(xì)胞和更有效的吞噬細(xì)胞。因此骨髓細(xì)胞移植可能成為AD的一種新的治療策略。 中藥十全大補(bǔ)湯由十味中草藥組成：黃芪、肉桂、當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地、人參、白術(shù)、茯苓、甘草，其組方內(nèi)含有多種免疫調(diào)節(jié)成分，可起到抗炎、抗氧化、抗過敏等作用。已經(jīng)證明：其不僅可以影響獲得 性免疫系統(tǒng)，還可影響固有免疫系統(tǒng)。這為我們立題于探討十全大補(bǔ)湯對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)病變中以MG為代表

4、的固有免疫系統(tǒng)可能起到一定的抗炎、抗氧化作用奠定了基礎(chǔ)。 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，給予AD轉(zhuǎn)基因小鼠口服十全大補(bǔ)湯能夠減少老年斑沉積，我們推測(cè)這可能是通過促進(jìn)MG對(duì)Aβ的吞噬作用實(shí)現(xiàn)的。本研究應(yīng)用十全大補(bǔ)湯萃取物，首先進(jìn)行體外刺激MG，考察其對(duì)MG的增殖、活化、對(duì)纖維化Aβ1-42的吞噬以及向神經(jīng)毒性／神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性轉(zhuǎn)歸的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，我們首先考察BMSC究竟是否能夠進(jìn)入正常腦，給予十全大補(bǔ)湯能否促進(jìn)其向正常腦組織的移行。另外，

5、我們通過海馬內(nèi)注射Aβ的方法模擬AD病變環(huán)境，考察給予十全大補(bǔ)湯能否通過促進(jìn)BMSC向病變部位的歸巢，進(jìn)而通過增加其對(duì)Aβ的吞噬而減輕病變，目的在于為AD的治療尋找新的契機(jī)。 方法： 原代培養(yǎng)MG(或使用Ra2細(xì)胞系)，以十全大補(bǔ)湯刺激后，用WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活化的表面標(biāo)志物CD11b，免疫熒光染色法檢測(cè)MG對(duì)纖維化Aβ1-42的吞噬，Griess法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO的含量，Bio-PlexTM

6、 Cytokine Assay檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中多種細(xì)胞因子的含量。 在體實(shí)驗(yàn)部分，通過給予小鼠移植表達(dá)EGFP的骨髓細(xì)胞建立了嵌合體鼠模型，以便追蹤外源性細(xì)胞入腦的情況。在實(shí)驗(yàn)一部分，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定小鼠血中GFP陽性細(xì)胞和CD11b陽性細(xì)胞比例數(shù)；用免疫組化方法檢測(cè)鼠腦實(shí)質(zhì)內(nèi)GFP陽性細(xì)胞和Iba1陽性細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)二部分，用免疫染色方法檢測(cè)鼠腦海馬Aβ注射病灶及病灶周圍聚集的GFP陽性細(xì)胞、非病灶臨近部位的GFP陽性細(xì)胞、并

7、鑒定GFP陽性細(xì)胞的表型。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0 for windows進(jìn)行。應(yīng)用單因素方差分析、重復(fù)測(cè)量方差分析或t檢驗(yàn)來判斷差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、十全大補(bǔ)湯對(duì)MG形態(tài)、增殖力及表面標(biāo)志物CD11b表達(dá)的影響 相差顯微鏡下觀察到用十全大補(bǔ)湯刺激后的原代MG由靜息狀態(tài)變成了細(xì)胞體大、突起短的阿米巴樣形態(tài)。十全大補(bǔ)湯增加MG的活力和增殖力，呈輕度的劑量依賴性。流

8、式細(xì)胞儀分析顯示：在對(duì)Ra2細(xì)胞處理48 hrs后，十全大補(bǔ)湯組CD11b陽性的活化MG所占的比例及其平均熒光強(qiáng)度兩指標(biāo)較陰性對(duì)照組相比均明顯增高。 2、十全大補(bǔ)湯對(duì)MG吞噬纖維化Aβ1-42的影響 在濃度依賴性實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過24 hrs的處理，200 μg/ml以上濃度的十全大補(bǔ)湯能夠顯著促進(jìn)MG對(duì)纖維化Aβ1-42的吞噬，但不顯示濃度依賴性。在時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)中，采用200 μg/ml的濃度，經(jīng)過24 hrs的處理可以得

9、到最大的吞噬細(xì)胞比例數(shù)60.4±4.4％，不顯示時(shí)間依賴性。 3、十全大補(bǔ)湯對(duì)MG產(chǎn)生NO及細(xì)胞因子的影響 單獨(dú)給予十全大補(bǔ)湯輕度增加NO的產(chǎn)量，但與陰性對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在存在纖維化Aβ1-42的條件下，盡管十全大補(bǔ)湯未顯示出減少NO產(chǎn)量的作用，但其并未顯示出促進(jìn)作用。 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，單獨(dú)給予十全大補(bǔ)湯對(duì)TNF-α的產(chǎn)量與陰性對(duì)照組相比沒有差異。在6 hrs時(shí)間點(diǎn)可以檢測(cè)到十全大補(bǔ)湯可以抑制纖維化Aβ1-

10、42產(chǎn)生TNF-α。IL-1 β、IL-6和IL-10的含量只在24 hrs處理后可明顯檢測(cè)到。單獨(dú)給予十全大補(bǔ)湯對(duì)IL-1β、IL-6和IL-10的產(chǎn)量與陰性對(duì)照組相比明顯增加；而且IL-10的含量還明顯高于纖維化Aβ1-42處理組。十全大補(bǔ)湯不顯示促進(jìn)或抑制纖維化Aβ1-42引起的IL-1β、IL-6和IL-10的產(chǎn)生。 4、流式細(xì)胞術(shù)鑒定實(shí)驗(yàn)一組小鼠血中GFP陽性細(xì)胞和CD 11 b陽性細(xì)胞比例數(shù) 嵌合鼠79％以上

11、的血白細(xì)胞由移植來源的骨髓細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組的CD11b陽性細(xì)胞占總血白細(xì)胞的比例數(shù)明顯高于對(duì)照組。 5、免疫組化方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一組腦實(shí)質(zhì)內(nèi)GFP陽性細(xì)胞和Ibal陽性細(xì)胞 在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠小腦內(nèi)均偶可見GFP陽性細(xì)胞，十全大補(bǔ)湯未顯示明顯作用。與對(duì)照組相比，十全大補(bǔ)湯明顯增加正常小鼠腦海馬區(qū)固有MG的數(shù)量。 6、免疫熒光染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二組腦海馬注射病灶及周圍的GFP陽性細(xì)胞

12、在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均發(fā)現(xiàn)注射病灶周圍和病灶內(nèi)部聚集了數(shù)量很多的GFP陽性細(xì)胞。而且，在PBS注射點(diǎn)及注射路徑周圍同樣可見GFP陽性細(xì)胞的聚集。 7、免疫組化染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二組鼠腦非病灶臨近部位GFP細(xì)胞 由于對(duì)病灶周圍GFP陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)難于得到很精確的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我們對(duì)腹側(cè)約3/5部分腦區(qū)內(nèi)的GFP陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比GFP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。 8、免疫熒光染色鑒定腦內(nèi)GFP細(xì)胞的表型 實(shí)

13、驗(yàn)二組小鼠無論是對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，腦內(nèi)注射病灶周圍區(qū)和遠(yuǎn)離病灶位置的GFP陽性細(xì)胞絕大部分呈現(xiàn)MG表型，未發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞表型的GFP細(xì)胞。 結(jié)論： 1、十全大補(bǔ)湯引起MG呈現(xiàn)明顯的活化形態(tài)。 2、十全大補(bǔ)湯促進(jìn)MG的增殖，并增加MG活化的表面標(biāo)志物CD11b的表達(dá)。 3、十全大補(bǔ)湯能夠促進(jìn)MG對(duì)纖維化Aβ1-42的吞噬。 4、十全大補(bǔ)湯在MG向神經(jīng)毒性/神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性的轉(zhuǎn)歸中起到平衡作用