蟾蜍毒素聯(lián)合丁酸鈉抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤是一種由多因素、多步驟、多基因改變的疾病，每種藥物均只能針對(duì)一種或幾種靶分子起作用，如果將多種抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)使藥物發(fā)揮更好的效果，聯(lián)合用藥將成為醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)。在美國(guó)舉行的ASCO會(huì)議提出了靶向治療、聯(lián)合用藥和應(yīng)用多靶向藥物的概念，這會(huì)比前幾代藥物更有效，產(chǎn)生更好的效果。有關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制到目前為止已經(jīng)有很多說(shuō)法，最近對(duì)于基因表型修飾以及信號(hào)傳導(dǎo)等的研究成為熱點(diǎn)。蟾蜍毒素是一種有效的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑。丁酸鈉SB(Sod

2、ium butyrate)是去乙?；敢种苿〩DACI(Histone deacetylase inhibitor)，通過(guò)對(duì)兩種藥物作用機(jī)理分析后，推斷聯(lián)合應(yīng)用這兩種藥物可能通過(guò)以下途徑起協(xié)同作用：①加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的周期抑制，使細(xì)胞阻滯在G1期；②抑制腫瘤周圍血管生成及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；③調(diào)節(jié)與腫瘤增殖、周期相關(guān)蛋白如P21 WAF1、P53和CDK4/CyclinD1蛋白的表達(dá)；④協(xié)同抑制細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。再加上我們對(duì)腫瘤細(xì)胞的篩選的前期

3、工作，我們認(rèn)為兩種藥物有其合用的必要性和理論依據(jù)。 本研究應(yīng)用以下實(shí)驗(yàn)方法： 1、胎盤(pán)藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量和MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，從而檢測(cè)蟾蜍毒素聯(lián)合丁酸鈉藥物合用后的效應(yīng)，篩選出兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用的最佳濃度和作用時(shí)間。 2、應(yīng)用WESTERN-BLOT檢測(cè)蛋白變化、半定量RT-PCR檢測(cè)基因變化。 3、流式細(xì)胞術(shù)PI單染色法檢測(cè)細(xì)胞周期，流式細(xì)胞術(shù)Annexin-PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，從而研究蟾蜍毒素

4、聯(lián)合丁酸鈉藥物合用后的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。 結(jié)果顯示： 1、蟾蜍毒素和丁酸鈉聯(lián)合應(yīng)用可以提高SMMC-7721細(xì)胞和A549細(xì)胞兩種腫瘤細(xì)胞的凋亡率，與單獨(dú)應(yīng)用藥物相比，差異具有顯著性(P<0.05)，但整體上我們所應(yīng)用的藥物濃度對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的程度并不顯著，聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物僅僅將SMMC-7721細(xì)胞單獨(dú)用藥的凋亡率從9.85％提高到14.57％，雖然他們之間具有顯著性差異，但是聯(lián)合用藥的誘導(dǎo)凋亡率不甚明顯，這也說(shuō)明在我們應(yīng)

5、用的藥物濃度下兩種藥物更多的是聯(lián)合抑制細(xì)胞的增殖而不是誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。 2、蟾蜍毒素和丁酸鈉聯(lián)合應(yīng)用后，在腫瘤的周期影響方面，單獨(dú)應(yīng)用任意一種藥物都可以將SMMC-7721細(xì)胞和A549細(xì)胞兩種腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。而聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物后可以將SMMC-7721細(xì)胞G1期阻滯為77.13％，將A549細(xì)胞G1期阻滯為78.32％，兩種腫瘤細(xì)胞G1期的阻滯更加明顯，與單獨(dú)用藥相比差異具有顯著性(P<0.05)

6、。 3、對(duì)基因和蛋白的影響發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)用藥也可以明顯的增強(qiáng)P53和周期負(fù)性調(diào)控蛋白P21的表達(dá)，抑制周期正性調(diào)控復(fù)合物CDK4/CyclinD1的表達(dá)。以SMMC-7721的P21基因?yàn)槔?，單?dú)應(yīng)用SB時(shí)P21表達(dá)值為0.5，而聯(lián)合用藥物后為0.65，與單獨(dú)用藥差異具有顯著性(P<0.05)。應(yīng)用P79350興奮P38MAPK激酶活性后，P53、P21基因和蛋白表達(dá)減弱，而CDK4/CyclinD1基因和蛋白表達(dá)增強(qiáng)。這說(shuō)明了協(xié)同

7、應(yīng)用蟾蜍毒素和丁酸鈉兩種藥物后通過(guò)P38MAPK增強(qiáng)了P53、P21的表達(dá)，降低了CDK4/CyclinD1復(fù)合物的表達(dá)。這也證明了P38MAPK的信號(hào)通路通過(guò)細(xì)胞周期而介導(dǎo)細(xì)胞的增殖，通過(guò)改變這些相應(yīng)的基因和蛋白的變化來(lái)調(diào)整A549細(xì)胞和SMMC-7721兩種細(xì)胞株的周期和凋亡的變化。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外試驗(yàn)的方法從用藥濃度、用藥時(shí)間以及從蛋白表達(dá)的水平和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等角度系統(tǒng)的論證了聯(lián)合應(yīng)用蟾蜍毒素和SB兩種藥物對(duì)幾種細(xì)胞株的抑