東北紅豆杉、飛機(jī)草的化學(xué)成分研究及土木香中活性成分的微生物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、第一部分東北紅豆杉針葉的化學(xué)成分研究
　　 目的：以東北紅豆杉（Taxuscuspidata）可再生針葉為研究對(duì)象，利用現(xiàn)代分離手段對(duì)其化學(xué)成分，尤其是紫杉烷類(lèi)化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，并采用波譜學(xué)及光譜學(xué)方法，包括：1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、NOESY、UV、IR、MS等對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行平面結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)的鑒定，為尋找新的抗癌活性先導(dǎo)化合物或藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：

2、取干燥后的東北紅豆杉針葉約3.2Kg，用95％的乙醇冷浸提取，濃縮后得到總提物。將總提物分散于蒸餾水中，石油醚脫脂后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯部位。依次用5％HCl水溶液、5％Na2CO3水溶液對(duì)乙酸乙酯部位進(jìn)行萃取，得到東北紅豆杉針葉的堿性部位約4.2g、酚性部位約3.4g、中性部位約82g。采用硅膠柱色譜法、葡聚糖凝膠SephadexLH-20、制備薄層色譜法和制備高效液相色譜法對(duì)以上三個(gè)部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離，得到的單體化合

3、物利用薄層色譜法及高效液相色譜法進(jìn)行純度檢識(shí)。單體化合物采用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、NOESY等光譜學(xué)和波譜學(xué)方法進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定。
　　 結(jié)果：從東北紅豆杉針葉中分離并鑒定了41個(gè)化合物，包括：37個(gè)紫杉烷類(lèi)化合物，2個(gè)木脂素類(lèi)化合物，1個(gè)倍半萜類(lèi)化合物和1個(gè)苯丙素類(lèi)化合物。
　　 結(jié)論：本研究對(duì)東北紅豆杉（Taxuscuspidata）可再生針葉的化學(xué)

4、成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，采用的按堿性成分、酚性成分及中性成分進(jìn)行分離的方法適用于本植物的成分分離。
　　 第二部分飛機(jī)草化學(xué)成分研究
　　 目的：本課題以飛機(jī)草全草為研究對(duì)象，對(duì)其化學(xué)成進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，運(yùn)用1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、NOESY、UV、IR、MS等波譜學(xué)及光譜學(xué)方法對(duì)得到的單體化合物進(jìn)行平面結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)的鑒定，通過(guò)活性篩選尋找到該植物中的活性成分，為其開(kāi)發(fā)與利用

5、提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：取粉碎后的飛機(jī)草藥材19Kg，用95％乙醇回流提取，得浸膏約1800g。將浸膏分散于蒸餾水中，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，減壓濃縮后分別得到石油醚部位29.5g、二氯甲烷部位101.2g和乙酸乙酯部位40g。采用硅膠柱色譜法、葡聚糖凝膠SephadexLH-20、制備薄層色譜法對(duì)以上三個(gè)部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離，得到單體化合物。采用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H

6、COSY、HMQC、HMBC、NOESY等光譜學(xué)和波譜學(xué)方法對(duì)各單體化合物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定。對(duì)飛機(jī)草中分得的16個(gè)化合物進(jìn)行了9株人腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試，以及對(duì)PPARγ和肝X受體激動(dòng)活性的測(cè)試。
　　 結(jié)果：從飛機(jī)草中分離得到35個(gè)單體化合物，對(duì)其中的28個(gè)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，包括：8個(gè)黃酮類(lèi)化合物，8個(gè)木脂素類(lèi)化合物，7個(gè)醌類(lèi)化合物，2個(gè)甾醇類(lèi)化合物、1個(gè)酰胺醇酯類(lèi)化合物、1個(gè)長(zhǎng)鏈有機(jī)酸和1個(gè)萘醌衍生物。
　　

7、 結(jié)論：從飛機(jī)草中分離并鑒定了28個(gè)化合物，其中自然界中首次發(fā)現(xiàn)的新化合物5個(gè)，分別為：1，2-亞甲二氧基-6-甲基蒽醌（6）、EO-12（12）、1，2，4-三甲氧基-3-羥基-6-甲基蒽醌（13）、1，2-二甲氧基-3-羥基-6-甲基蒽醌（14）、5，7-二甲氧基松脂素（29）；該植物中首次發(fā)現(xiàn)的化合物16個(gè)，分別為：化合物3、4、9、10、16、20、23、24、25、27、28、30、31、32、33、34。
　　 首

8、次發(fā)現(xiàn)1，2-二甲氧基-3-羥基-6-甲基蒽醌（14）對(duì)人非小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞（PC-6）具有增值抑制活性，其IC50為15.56μg/mL；首次發(fā)現(xiàn)飛機(jī)草素（1）對(duì)PPARγ具有較強(qiáng)的激動(dòng)活性，其EC50為1.10μg/mL。
　　 第三部分土木香中活性成分的微生物轉(zhuǎn)化研究微生物轉(zhuǎn)化，即指外源性化學(xué)物或稱(chēng)底物在微生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)多種酶催化的代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程。在天然藥物化學(xué)研究中可用于進(jìn)行活性化合物的結(jié)構(gòu)修飾，豐富其化學(xué)結(jié)構(gòu)，從中尋找到活

9、性更好或副作用更小的先導(dǎo)化合物，繼而進(jìn)行新藥的開(kāi)發(fā)。另外，還可以通過(guò)體外生物反應(yīng)過(guò)程模擬藥物在人體內(nèi)的代謝行為，獲得一定量的代謝產(chǎn)物用于藥物的體內(nèi)代謝研究。
　　 異土木香內(nèi)酯（Isoalantolactone）屬桉烷型倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，為菊科旋覆花屬植物土木香（InulaheleniumL）的主要成分，本課題對(duì)收集自河北、內(nèi)蒙、河南、四川等地的十余批次的土木香進(jìn)行的含量測(cè)定結(jié)果表明，異土木香內(nèi)酯的含量高達(dá)1.2～5.6％。藥

10、理學(xué)研究表明異土木香內(nèi)酯具有較強(qiáng)的驅(qū)蟲(chóng)、抗原蟲(chóng)、抗菌等活性，具有開(kāi)發(fā)為藥物的潛力。本研究以異土木香內(nèi)酯為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的研究，為這一資源豐富、活性較好的單體化合物的開(kāi)發(fā)利用做基礎(chǔ)研究。
　　 目的：利用真菌對(duì)異土木香內(nèi)酯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究，以期得到新的異土木香內(nèi)酯衍生物或活性更強(qiáng)、毒性更小的化合物用于該單體的藥物研發(fā)。同時(shí)模擬異土木香內(nèi)酯在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝，為研究該單體在體內(nèi)代謝，闡明其在體內(nèi)發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)

11、提供基礎(chǔ)研究。
　　 方法：取粉碎后的土木香根5Kg用99％乙醇冷提，所得浸膏分別用石油醚、二氯甲烷進(jìn)行萃取，采用硅膠柱色譜法和硝酸銀硅膠柱色譜法制備得到異土木香內(nèi)酯單體。以異土木香內(nèi)酯為底物，對(duì)47株真菌進(jìn)行篩選，選擇轉(zhuǎn)化率較高、轉(zhuǎn)化多樣性較好的真菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后減壓濾取發(fā)酵液，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，經(jīng)硅膠柱色譜分離得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并通過(guò)MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HMBC、HMQC等方法對(duì)轉(zhuǎn)

12、化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　 結(jié)果：從土木香根中分離得到包括異土木香內(nèi)酯在內(nèi)的5個(gè)單體化合物，分別鑒定為土木香內(nèi)酯（1a）、異土木香內(nèi)酯（1b）、β-谷甾醇（2）、5α-環(huán)氧土木香內(nèi)酯（3）和雙咖啡酸酯（4）。從47株真菌中篩選出2株真菌可對(duì)底物異土木香內(nèi)酯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，即刺囊毛霉AS3.3450和黑曲霉AS3.1858。選擇轉(zhuǎn)化多樣性較好且轉(zhuǎn)化效率較高的AS3.3450進(jìn)行放大培養(yǎng)，得到3個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分別鑒定為：3α-羥基異土木

13、香內(nèi)酯（Z-1a）、3α-羥基-11，13-二氫異土木香內(nèi)酯（Z-1b）和2α-羥基異土木香內(nèi)酯（Z-2）。
　　 結(jié)論：從土木香根中分離得到5個(gè)單體化合物，均為該植物中的已知化學(xué)成分；硝酸銀硅膠柱色譜法對(duì)于分離土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯這對(duì)結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體具有較好的分離效果；通過(guò)刺囊毛霉AS3.3450對(duì)異土木香內(nèi)酯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化得到的3個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均為已知化合物。
　　 第四部分土木香藥材HPLC指紋圖譜研究及含量測(cè)定

14、目的：建立土木香藥材的指紋圖譜，測(cè)定其主要成分土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的含量，為土木香藥材的鑒別及質(zhì)量控制提供依據(jù)。
　　 方法：指紋圖譜研究的色譜條件：HICHROMC18（250mm×4.6mm，5.0μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；含量測(cè)定的色譜條件：HICHROMC18（250mm×4.6mm，5.0μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1％甲酸溶液梯度洗脫

15、（0～3min，乙腈65％等度洗脫；3～10min乙腈由65％線(xiàn)性梯度至55％；10～15min乙腈55％等度洗脫），運(yùn)行時(shí)間15min。流速1.0mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。
　　 結(jié)果：1.采用HPLC-DAD法建立了土木香藥材的指紋圖譜，精密度試驗(yàn)：各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.2％和1.7％；重復(fù)性試驗(yàn)：各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.2％和2.8％；穩(wěn)定性試驗(yàn)：

16、各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1.4％和1.8％。15批土木香藥材的相似度在0.848～0.989之間。2.采用HPLC法建立了土木香內(nèi)酯及異土木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法，線(xiàn)性范圍：土木香內(nèi)酯0.571～2.86μg·L-1，異土木香內(nèi)酯0.325～1.62μg·L-1；精密度試驗(yàn)：RSD分別為0.46％和1.13％；重復(fù)性試驗(yàn)：RSD分別為1.68％和0.85％；回收率試驗(yàn)：土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的平均回收率分別為98.

17、5％和99.4％，RSD分別為1.37和1.00（n=6）；樣品在24h之內(nèi)穩(wěn)定。15批土木香及土木香對(duì)照藥材的土木香內(nèi)酯含量在6.66～48.00mg/g之間，異土木香內(nèi)酯含量在12.64～55.67mg/g之間。
　　 結(jié)論：本研究方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性和精密度良好，可作為土木香藥材的指紋圖譜及含量測(cè)定的方法。首次建立了土木香藥材的HPLC指紋特征圖譜，建立了河北產(chǎn)土木香藥材指紋圖譜的共有模式，同時(shí)測(cè)定了兩個(gè)主成分土木香內(nèi)酯和