基于金納米顆粒和發(fā)夾型核酸探針電化學(xué)檢測(cè)DNA甲基化酶.pdf

1、DNA甲基化是表觀遺傳中最主要的作用方式，其在基因表達(dá)調(diào)控、基因組印跡、胚胎發(fā)育、維持正常細(xì)胞功能等過(guò)程中起著極其重要的作用。人類許多重大疾病如癌癥、遺傳性疾病都與DNA甲基化以及甲基化酶的活性密切相關(guān)。因此，研究DNA甲基化過(guò)程和分析DNA甲基化酶活性，受到了研究者們的廣泛關(guān)注。由于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在耗時(shí)、不連續(xù)、大多需要放射性標(biāo)記等缺點(diǎn)，于是發(fā)展新的簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏的甲基化監(jiān)測(cè)手段和甲基化酶檢測(cè)方法便已成為生化分析和臨床診斷等領(lǐng)域愈

2、加迫切的需求。電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、響應(yīng)快速、易于微型化、測(cè)試費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，在各種目標(biāo)物的檢測(cè)中得到了廣泛的研究和應(yīng)用，也為DNA甲基化和DNA甲基化酶的研究提供了新的契機(jī)。本論文以甲基化酶活性的高靈敏檢測(cè)為目標(biāo)，基于核酸分子探針及納米材料信號(hào)放大作用構(gòu)建了不同的電化學(xué)生物傳感器，主要包括以下三方面的研究工作：
　　一、基于金納米顆粒信號(hào)放大作用的DNA甲基化酶免標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)
　　利用DNA功能化金納米顆

3、粒的信號(hào)放大作用，發(fā)展了一種便捷、高靈敏電化學(xué)檢測(cè)Dam甲基化酶活性的新方法。首先在金電極上修飾單鏈DNA，當(dāng)不存在Dam甲基化酶時(shí)，互補(bǔ)DNA修飾的金納米顆粒通過(guò)雜交作用，靠近電極表面，此時(shí)是“eT OFF”狀態(tài)；當(dāng)檢測(cè)體系中有Dam甲基化酶和Dpn I限制性內(nèi)切酶時(shí)，DNA雙鏈被甲基化并切斷，使得金納米顆粒遠(yuǎn)離電極表面，電子可以自由傳遞，產(chǎn)生可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)(eT ON)。金納米顆粒自身的空間位阻作用會(huì)阻礙電極表面的電子傳遞，同時(shí)

4、，金納米顆粒上修飾有大量帶負(fù)電荷的DNA，由于靜電斥力，進(jìn)一步阻礙帶負(fù)電荷的電活性物質(zhì)鐵氰化鉀與電極表面的電子傳遞，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Dam甲基化酶的特異性檢測(cè)，檢測(cè)限為0.12U/mL，并且能用于對(duì)甲基化酶敏感藥物的篩選。
　　二、基于甲基化響應(yīng)的發(fā)夾型捕獲探針電化學(xué)檢測(cè)DNA甲基化酶活性
　　結(jié)合亞甲基藍(lán)標(biāo)記的報(bào)告探針和甲基化響應(yīng)的發(fā)夾型捕獲探針，構(gòu)建了一種靈敏的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)甲基化酶活性。在該

5、方法中，發(fā)夾型捕獲探針的莖部包含甲基化酶識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)甲基化酶不存在時(shí)，發(fā)夾型結(jié)構(gòu)保持完整，捕獲探針?lè)忾]在其莖部結(jié)構(gòu)中，這阻礙了報(bào)告探針與捕獲探針之間的雜交，使得標(biāo)記在報(bào)告探針上的電活性物質(zhì)亞甲基藍(lán)不能靠近電極表面，處于“eT OFF”狀態(tài)。而當(dāng)甲基化酶存在時(shí)，該位點(diǎn)被甲基化，進(jìn)而被限制性內(nèi)切酶切割，使得與報(bào)告探針互補(bǔ)的捕獲鏈暴露出來(lái)，通過(guò)DNA鏈之間的互補(bǔ)配對(duì)，報(bào)告探針上標(biāo)記的亞甲基藍(lán)靠近電極，從而發(fā)生電子傳遞，產(chǎn)生可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)。

6、以Dam甲基化酶為例，該方法檢測(cè)限為0.07U/mL，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基化酶的動(dòng)力學(xué)研究及相關(guān)抑制劑篩選。
　　三、基于發(fā)夾型探針和G-四聚體結(jié)構(gòu)免標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)DNA甲基化酶
　　將電活性物質(zhì)Hemin可以特異性的與富G序列結(jié)合形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的G-四聚體這一特性，應(yīng)用于甲基化酶活性的電化學(xué)檢測(cè)。設(shè)計(jì)了甲基化響應(yīng)的發(fā)夾型探針，其莖部包含甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)及一段特異性的富G序列，當(dāng)甲基化酶不存在時(shí)，該序列被封鎖在發(fā)夾型探針的