天敵應激對腦不對稱BALB-c小鼠CRH表達的影響.pdf

1、1.背景和目的：
　　腦不對稱是機體的生物學特性之一,主要表現(xiàn)在大腦左右兩半球在解剖結(jié)構(gòu)、遞質(zhì)分泌以及功能等方面存在異質(zhì)性。研究表明,在神經(jīng)內(nèi)分泌環(huán)路(尤其是下丘腦-垂體-腎上腺軸,HPAaxis)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的橋梁作用下,腦不對稱可以參與免疫功能的異質(zhì)調(diào)控,影響細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生,但機制尚不清楚。
　　促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin-Releasing Hormone,CRH)在應對壓力源調(diào)

2、節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和行為反應中起著重要作用,CRH的免疫反應活性在不同的腦區(qū)中檢測到,包括下丘腦室旁核(Paraventricular nucleus,PVN),視上核,杏仁核,弓狀核,藍斑,皮質(zhì),終紋床核和新皮層的區(qū)域。在這些結(jié)構(gòu)中,下丘腦室旁核是腦內(nèi)CRH的主要來源,并且被認為是大腦的應激反應的綜合性中心。腦不對稱是機體普遍存在的生物學現(xiàn)象。研究證實,大腦的不對稱可以影響神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能。通過動物實驗以及臨床觀察發(fā)現(xiàn),大腦左右兩半球?qū)ι?/p>

3、經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能具有相反的調(diào)節(jié)功能,而且,動物以及人類不對稱與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)間也存在密切的關(guān)系。目前,對于腦不對稱是否對應激后小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)CRH特定區(qū)域分布具有影響作用尚不清楚。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)腦不對稱可以影響天敵應激后皮質(zhì)酮(Corticosteron,CS)以及細胞因子的產(chǎn)生。CRH在大鼠腦內(nèi)的分布早已被認同,而對于小鼠腦內(nèi)的分布和特征以及腦不對稱是否調(diào)節(jié)CRH的特定區(qū)域分布尚未見詳細報道。因此,本研究使用實

4、時定量PCR(Real-Time PCR)和免疫組織化學(IHC)的方法檢測左右皮質(zhì),下丘腦,左右海馬三個腦區(qū)中CRH的mRNA和陽性神經(jīng)元的表達水平,為進一步研究CRH與應激反應的相關(guān)性及腦內(nèi)不同區(qū)域在應激反應中的作用以及腦不對稱對神經(jīng)免疫功能的調(diào)控是否具有異質(zhì)性提供理論和實驗依據(jù)。同時,通過實時定量PCR和ELISA分別檢測應激后不同時間點CRH,GR和CS的表達變化來探討天敵應激下腦不對稱性對小鼠HPA軸的調(diào)節(jié)。
　　2.材

5、料與方法：
　　健康雌性BALB/C小鼠101只,運用伸爪取食按右利分(伸爪50次中伸右爪的次數(shù))給每只小鼠評分,將小鼠區(qū)別為左利鼠、右利鼠和雙利鼠3組。小鼠隨機分為三組,急性應激組貓暴露應激1次,持續(xù)60min;慢性應激組則每天一次,每次60min,持續(xù)14天,;對照組則不做任何貓暴露應激實驗,置于鼠籠中正常飼養(yǎng)。天敵應激后0h,2h,6h,12h快速斷頭殺鼠,用放置于冰上并肝素化的試管收集血液,經(jīng)4,000rpm離心15min

6、后取血漿用于檢測血漿皮質(zhì)酮;并迅速分離出左右側(cè)皮層、左右雙側(cè)海馬、下丘腦。
　　3.結(jié)果：
　　3.1、Real Time PCR結(jié)果表明腦不對稱小鼠正常生理狀況下促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素在左利鼠和右利鼠海馬和皮質(zhì)的的表達水平較低,且水平相近,下丘腦是三個腦區(qū)中表達量最高的,與海馬比差異具有顯著性(P<0.05)。
　　3.2、天敵應激后,其中急性應激后,左、右利鼠皮層和下丘腦CRHmRNA較正常組差異不明顯,而右利鼠

7、左側(cè)海馬CRHmRNA水平升高,與相應正常生理組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。慢性應激后,右利鼠左側(cè)海馬CRH水平下調(diào),與相應急性應激組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而左側(cè)海馬CRHmRNA水平較右側(cè)海馬低,差異具有統(tǒng)計學意義;下丘腦CRH水平明顯升高,左利鼠與相應正常生理組比較有統(tǒng)計學差異,右利鼠與相應正常生理組與急性應激組比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05),其中以右利鼠CRHmRNA升高最為顯著,左利鼠次之。急性應激0h,2

8、h,6h,12h后小鼠下丘腦中CRHmRNA與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異。
　　3.3、腦不對稱小鼠皮層、海馬和下丘腦CRH的組織定位:免疫化學結(jié)果顯示,CRH在腦內(nèi)各個腦區(qū)均有廣泛表達,但表達較弱。大部分免疫反應陽性產(chǎn)物分布在神經(jīng)元核內(nèi)。在下丘腦,尤以室旁核最為密集;在海馬結(jié)構(gòu)內(nèi),海馬錐體細胞、齒狀回顆粒細胞均呈陽性。
　　3.4、腦不對稱小鼠血漿皮質(zhì)酮水平:正常生理狀況下,左利、右利鼠皮質(zhì)酮水平較低;水平相近;慢性應激后

9、,血漿皮質(zhì)酮水平右利鼠與對照組相比具有顯著性升高(P<0.05)。急性應激0h,2h,6h,12h后小鼠血漿中CS水平與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異。
　　3.5、腦不對稱小鼠海馬GRmRNA在正常生理狀況下左利鼠的雙側(cè)海馬區(qū)中GRmRNA的表達高于右利鼠,差異具有顯著性意義。左利鼠急、慢性應激后GRmRNA下調(diào),與相應正常生理組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.結(jié)論：
　　4.1、CRH在腦不對稱小鼠的皮層、

10、海馬和下丘腦均有表達,且尤以下丘腦室旁核表達量最高,為腦內(nèi)CRH的主要來源。小鼠在天敵應激下,CRH在不同腦區(qū)的表達水平受大腦的異質(zhì)調(diào)控,表現(xiàn)為右利鼠CRH慢性應激后高于左利鼠。血漿CS及海馬GRmRNA均表現(xiàn)為右利鼠較左利鼠變化敏感,提示精神應激下腦不對稱性對免疫內(nèi)分泌功能有影響。
　　4.2、天敵應激對腦不對稱小鼠腦組織中CRH表達的異質(zhì)性與HPA軸功能的不對稱性密切相關(guān),左利鼠HPA軸的活性與反應性較右利鼠弱。
　　4