亞甲藍(lán)光化學(xué)法對血液及血制品中淋巴細(xì)胞及病毒的滅活效果及其機(jī)理.pdf

1、輸血是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不可或缺的治療手段，且隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展以及社會老齡化程度的提高，臨床上對血液的需求持續(xù)增加，輸血的重要性愈加彰顯。然而，輸血亦可能發(fā)生不良反應(yīng)，嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng)甚至可給受血者帶來災(zāi)難性的后果。受血者遭遇輸血不良反應(yīng)的可能性稱為輸血風(fēng)險(xiǎn)，由于輸血治療涉及臨床各科，覆蓋范圍廣、其個(gè)案累計(jì)絕對數(shù)相當(dāng)可觀，因此，如何在確保臨床輸血療效的同時(shí)防范輸血風(fēng)險(xiǎn)一直是世界衛(wèi)生組織、各國衛(wèi)生行政部門和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

2、　　 輸血風(fēng)險(xiǎn)包括感染性風(fēng)險(xiǎn)及非感染性風(fēng)險(xiǎn)兩大類。感染性風(fēng)險(xiǎn)由可通過輸血傳播的病原微生物構(gòu)成，其中包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等多種病毒以及細(xì)菌和原蟲等。非感染性輸血風(fēng)險(xiǎn)則主要由免疫因素引起的輸血不良反應(yīng)所構(gòu)成。輸血相關(guān)的移植物抗宿主病(TA-GVHD)則是后果最為嚴(yán)重的非感染性風(fēng)險(xiǎn)之一，它是由輸注了一定數(shù)量的具有免疫活性的異體淋巴細(xì)胞所引起的致命性輸血并發(fā)癥，目前尚無有效的治療措施，

3、一旦罹患，死亡率高達(dá)90％以上。
　　 血液成分的病原體滅活技術(shù)是阻斷輸血傳播病原體，保障輸血安全的重要防線。亞甲藍(lán)光化學(xué)法是可用于單袋血漿病毒滅活的病原體滅活技術(shù)，已在我國和部分歐洲國家應(yīng)用于臨床，其有效性及安全性已得到證實(shí)。亞甲藍(lán)是一種帶正電荷的小分子化合物，可穿過病毒的包膜與核酸結(jié)合，并在吸收可見光提供的能量后發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，介導(dǎo)核酸損傷，阻止核酸復(fù)制從而導(dǎo)致病原體的滅活。根據(jù)這一原理，理論上該方法也同樣適用于淋巴細(xì)胞的滅

4、活從而達(dá)到預(yù)防TA-GVHD的目的。該原理還為利用核酸擴(kuò)增技術(shù)評價(jià)亞甲藍(lán)病毒滅活效果奠定理論基礎(chǔ)。
　　 目的：1)研究亞甲藍(lán)光化學(xué)法對人外周血淋巴細(xì)胞在細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌方面的作用，并對淋巴細(xì)胞滅活機(jī)理進(jìn)行探討。2)進(jìn)一步深入研究亞甲藍(lán)光化學(xué)法對病毒的滅活效果及其機(jī)理，建立熒光定量PCR技術(shù)對亞甲藍(lán)病毒滅活效果的評價(jià)方法，并通過無感染性的可度量核酸破壞程度的質(zhì)控品建立更為安全、有效的病毒滅活效果評價(jià)體系。
　　 方

5、法：1)向人外周血淋巴細(xì)胞中加入終濃度3μM的亞甲藍(lán)，將混勻后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至PVC儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活箱中，在照射強(qiáng)度為35000lux的熒光光源下照射50min，作為實(shí)驗(yàn)組。將淋巴細(xì)胞在輻射劑量為25Gy的γ射線下輻照作為輻照組。將處理前后的樣品進(jìn)行淋巴細(xì)胞形態(tài)、存活趨勢、增殖抑制率、細(xì)胞因子分泌以及細(xì)胞凋亡等檢測，分析亞甲藍(lán)光化學(xué)作用對淋巴細(xì)胞的滅活效果及其機(jī)理。2)亞甲藍(lán)光化學(xué)法對Sindbis病毒的滅活處理?xiàng)l件如下：a.

6、將病毒懸液于避光條件下加入亞甲藍(lán)，使其終濃度為1μmol/L，將病毒懸液轉(zhuǎn)移至儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活照射箱中，在光照強(qiáng)度為15000 lux的熒光光源下照射，分別于光照0、1、3、5、7、10、20、30min時(shí)取樣檢測；b.將病毒懸液于避光條件下加入亞甲藍(lán)，使其終濃度為1μmol/L，將病毒懸液轉(zhuǎn)移至儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活照射箱中，分別于光照強(qiáng)度為0 lux、2000 lux、5000 lux、10000 lux、20000

7、lux、30000 lux和40000lux的熒光光源下照射5min后取樣檢測；c.將病毒懸液于避光條件下加入亞甲藍(lán)，使其終濃度分別為0μmol/L、0.1μmol/L、0.51μmol/L、0.7μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L，將病毒懸液轉(zhuǎn)移至儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活照射箱中，在光照強(qiáng)度為15000lux的熒光光源下照射5min后取樣檢測。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有樣品均平行檢測其病毒殘余滴度并

8、通過定量PCR檢測樣品中病毒核酸含量，分析病毒感染性的下降與其核酸損傷之間的相關(guān)性。向HCV血漿、熱力預(yù)滅活的Sindbis病毒懸液及HCV病毒樣顆粒中加入終濃度lμM的亞甲藍(lán)并將樣品轉(zhuǎn)移至儲血袋，于4℃病毒滅活箱中在光照強(qiáng)度為35000lux的熒光光源下光照30min，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣并通過定量PCR檢測樣品中核酸含量，探討定量PCR技術(shù)評價(jià)亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活效果的可行性，同時(shí)分析HCV血漿、熱力預(yù)滅活的Sindbis病毒及HCV病

9、毒樣顆粒作為度量病毒核酸破壞程度質(zhì)控品的可行性。
　　 結(jié)果：1)亞甲藍(lán)光化學(xué)法能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子分泌。熒光染色及細(xì)胞存活趨勢結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組活性細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組及輻照組。實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞在PHA刺激下其增殖集落明顯小于其他處理組；PHA刺激后3d、4d、5d的增殖抑制率分別為89.31％、100％和94.39％，均高于輻照組。經(jīng)PHA刺激后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的分泌量顯

10、著低于PHA刺激后的對照組，TNF-α、IL-2和IL-12的分泌量與對照組沒有顯著性差異；經(jīng)PHA刺激后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞除IL-12外，其余細(xì)胞因子的分泌量均顯著低于PHA刺激后的輻照組細(xì)胞；除TSF-α和IL-8外，PHA刺激的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞細(xì)胞因子分泌量與未經(jīng)PHA刺激之間無顯著性差異。亞甲藍(lán)光化學(xué)作用后的淋巴細(xì)胞未檢測到caspase-3、caspase-6的蛋白活性以及DNA Ladder、未出現(xiàn)明顯的磷脂酰絲氨酸外翻，推斷亞甲藍(lán)光化

11、學(xué)作用導(dǎo)致了淋巴細(xì)胞的無序死亡。2)在上述a、b、c三種亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活處理Sindbis病毒的條件下，Sindbis病毒的滅活效果最終均達(dá)6.0 Log TCID50以上，且病毒核酸含量的下降與病毒感染性的消失均具有線性相關(guān)性(R2>0.94.)，方差分析顯示兩者間具有極顯著的線性相關(guān)性(F<0.01)。HCV血漿、熱力預(yù)滅活的Sindbis病毒均與活性Sindbis病毒具有相似的核酸動力學(xué)曲線及擴(kuò)增抑制曲線；HCV病毒樣顆粒與HCV

12、血漿具有相似的核酸動力學(xué)曲線及擴(kuò)增抑制曲線，且兩者的核酸下降量呈現(xiàn)極顯著的線性相關(guān)性(R2>0.99)。
　　 結(jié)論：1)亞甲藍(lán)光化學(xué)作用可以有效滅活淋巴細(xì)胞，抑制其細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌(國內(nèi)首次報(bào)道)。2)亞甲藍(lán)光化學(xué)作用可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的無序死亡(首次發(fā)現(xiàn))。3)亞甲藍(lán)光化學(xué)法造成了病毒核酸的損傷，且通過病毒核酸含量下降與病毒感染性消失的平行觀察證實(shí)核酸是亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活的主要作用靶點(diǎn)，并為熒光定量PCR技術(shù)評價(jià)亞甲藍(lán)