黃翅大白蟻中腸木質纖維素降解相關酶類的序列分析與表達研究.pdf

1、白蟻是一種社會性昆蟲，在土壤的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，因此，白蟻又被稱為生態(tài)系統(tǒng)工程師。根據(jù)腸道共生物中是否存在原生動物，可將白蟻分為低等白蟻和高等白蟻。而在分類學上，僅白蟻科為高等白蟻，但數(shù)目卻占全部白蟻的75％。相對于低等白蟻的研究，目前對高等白蟻木質纖維素降解機制的研究還相對較少。
　　本文的研究材料黃翅大白蟻（Macrotermesbarneyi，Isoptera:Macrotermitidae）是一種與真菌共生高等培菌

2、白蟻，廣泛分布于我國南方。研究表明，不僅培菌白蟻的共生真菌具有木質纖維素的降解能力，白蟻腸道內(nèi)存在的內(nèi)源性的纖維素酶，可能也在纖維素降解過程中發(fā)揮重要作用。我們實驗室前期對黃翅大白蟻腸道木質纖維素降解酶活性研究發(fā)現(xiàn)，中腸的酶活性最高。中腸轉錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)預測為木質纖維素降解酶的unigenes，包括:漆酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶、阿魏酸酯酶等等。為研究這些unigenes編碼蛋白的功能以及其在培菌白蟻木質纖維素降解中發(fā)揮的作用，

3、本研究分別對上述四種酶進行了基因克隆和表達研究，具體內(nèi)容如下:
　　對黃翅大白蟻中腸漆酶進行基因組序列的擴增，共擴增得到長約10kb的序列，其中共有8個內(nèi)含子，將外顯子分成9段。此外，在內(nèi)含子和外顯子區(qū)，各有一段序列因預測為二級結構，所以未能測序成功。以基因組序列作為已知序列，進行染色體步移，成功擴增漆酶的3'側翼序列，該序列包含有預測為昆蟲來源的轉座子序列，證實該漆酶為昆蟲來源。為了對漆酶的酶活性質進行更好的分析，本論文同時嘗試

4、建立昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，對漆酶進行異源表達。結果顯示，表達系統(tǒng)構建成功但是漆酶沒有表達。
　　對黃翅大白蟻中腸轉錄組測序預測的3條β-葡萄糖苷酶unigenes進行分析，其中10737蛋白為GH30家族的來源，而10810和59997蛋白為GH1家族的來源。采用RACE方法成功擴增3個含有完整開放讀碼框的基因，并對這三條基因的蛋白序列進行比對分析和誘導表達分析。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，10810和59997具有GH1家族的保守結構位點

5、，證實其為GH1家族蛋白;而10737的結構位點未知，僅預測為GH30家族蛋白。系統(tǒng)進化樹分析預測10810和59997蛋白都為昆蟲來源。異源表達研究發(fā)現(xiàn)，蛋白10810能夠在原核表達系統(tǒng)E.coli和畢赤酵母表達系統(tǒng)GS115中表達但沒有活性。蛋白59997和10737在大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng)中均不能表達，密碼子優(yōu)化后的10737cDNA能夠在大腸桿菌中表達，但是沒有檢測到活性。而優(yōu)化后的59997蛋白則仍舊沒有表達。將MbBG、

6、BG-10737、59997、10810在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達，但westernblot并沒有檢測到信號，具體原因還需要進一步的分析。
　　分別擴增轉錄組測序中預測為過氧化物酶(75774)與阿魏酸酯酶(82227)的cDNA序列，使用RACE法成功擴增得到這兩條序列，但預測結果顯示，75774為動物過氧化物酶家族的無脊椎動物的細胞黏附蛋白，預測其功能為參與細胞黏連;而預測為阿魏酸酯酶的82227序列則為酯酶脂肪酶超家族的保

7、幼激素酯酶，是參與昆蟲變態(tài)與發(fā)育的重要的酶。
　　總之，本研究擴增得到漆酶的基因序列且證實該漆酶為昆蟲來源漆酶，但是該漆酶沒有在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達。本文同時利用RACE的方法擴增獲得3條預測為β-葡萄糖苷酶的cDNA全長序列，并分別進行了異源表達嘗試，其中10810蛋白和密碼子優(yōu)化后的10737蛋白都能夠進行異源表達但沒有酶活性。此外，本研究還擴增得到預測為過氧化物酶和阿魏酸酯酶的cDNA序列，但全長序列分析結果表明這兩個