黑翅土白蟻內(nèi)源性纖維素酶基因在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上儲(chǔ)量最大的可再生的生物質(zhì)資源。在其降解過程中，至少需要三種纖維素酶的協(xié)同作用，即內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(EGase)、外切-β-1，4-葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BGase)。食木性白蟻是纖維素消化率最高的昆蟲，亦被稱為自然纖維素的主要降解者和分泌產(chǎn)生纖維素酶的最大群體。白蟻纖維素酶主要包括外源性纖維素酶和內(nèi)源性纖維素酶，其自身由唾液腺組織和中腸細(xì)胞分泌產(chǎn)生EGase和BGase，屬于內(nèi)源性纖維素酶。為完

2、成纖維素類食物的消化與吸收，白蟻需要外源性纖維素酶的協(xié)助:低等白蟻由后腸共生微生物提供，而高等白蟻后腸缺乏原生動(dòng)物，主要通過取食其巢體上的共生真菌來獲取。
　　本文在前人對(duì)黑翅土白蟻體內(nèi)纖維素酶活性及編碼基因異源表達(dá)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步克隆編碼成熟纖維素酶基因，切除信號(hào)肽，利用常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)蛋白酶的分泌型表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)做了初步探究，為今后進(jìn)一步優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)纖維素酶的發(fā)酵條件，及更好地服務(wù)工業(yè)化應(yīng)用生產(chǎn)單糖或生物

3、乙醇奠定了基礎(chǔ)。
　　1、編碼成熟纖維素酶基因的克隆
　　通過提取黑翅土白蟻工蟻唾液腺的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和克隆得到黑翅土白蟻體內(nèi)編碼編碼內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(EGase)和β-葡萄糖苷酶(BGase)的成熟肽和完整蛋白的eDNA序列:OfEG和OfBG,即已去除基因前端的信號(hào)肽序列，為進(jìn)一步的胞外表達(dá)做準(zhǔn)備。
　　2、纖維素酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)
　　通過PCR將目的基因的兩端都加上SacⅡ和XbaⅠ酶

4、切位點(diǎn)，插入到常用的分泌型畢赤酵母表達(dá)載體pPICZaA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZaA-OfEG和pPI CZaA-OfBG。通過電轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒線性化后導(dǎo)入宿主菌株畢赤酵母KM71中表達(dá)。挑取高拷貝的重組子克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示SDS-PAGE蛋白條帶雖不清晰，但利用帶His標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western blot分析得到位于45.0和66.2 kDa之前的兩條帶，證明兩種目的蛋白的胞外表達(dá)得以成功實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)條件

5、的進(jìn)一步優(yōu)化，明確了適用于表達(dá)工作的最佳甲醇誘導(dǎo)濃度1.5％和最佳初始pH6.0。此外，還初步探究了兩種重組纖維素酶的部分酶學(xué)性質(zhì)。
　　研究結(jié)果表明:重組EG的最適反應(yīng)pH為5.5，最佳反應(yīng)溫度為45℃，重組BG的最適反應(yīng)pH為6.0，最佳反應(yīng)溫度為50℃;不同金屬離子對(duì)兩種重組纖維素酶的酶活影響不同，表現(xiàn)為:正二價(jià)金屬離子Mn2+、Zn2+、Cr2+對(duì)重組EGase和重組BGase的酶活都具有促進(jìn)作用，其中Mn2+相對(duì)活力均超

6、過150％;而Cu2+對(duì)兩者都表現(xiàn)出明顯的抑制作用;正一價(jià)金屬離子K+、Na+對(duì)兩種酶的活力沒有明顯影響;將兩種重組纖維素酶按不同配比混合進(jìn)行協(xié)同作用試驗(yàn)，結(jié)果表明混合酶的酶活均高于單個(gè)重組酶的酶活，表現(xiàn)出明顯的正協(xié)同作用。且當(dāng)配比為1∶1時(shí)，正協(xié)同作用效果最佳，濾紙酶活達(dá)0.448U，比相同條件下測得的重組EGase和重組BGase的PFA分別約高出75.00％、113.3％。
　　本研究從黑翅土白蟻中獲取了編碼成熟的內(nèi)切-β-