基于NMR-UPLC植物代謝組學(xué)技術(shù)的遠(yuǎn)志質(zhì)量評(píng)價(jià)研究.pdf

1、選題依據(jù):遠(yuǎn)志是遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志或卵葉遠(yuǎn)志的干燥根，具有安神益智，祛痰，消腫之功效，是臨床常用藥物。目前遠(yuǎn)志資源利用存在以下問題:①遠(yuǎn)志全草包括根和莖葉，傳統(tǒng)認(rèn)為其藥用部位為根，莖葉部分常在根采收后被丟棄;②遠(yuǎn)志根又由韌皮部（筒）和木質(zhì)部（心）組成，傳統(tǒng)認(rèn)為木心有“服之令人悶”的副作用，使用時(shí)應(yīng)去掉，以筒入藥，而現(xiàn)代毒理研究則表明木心無毒副作用，《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定根不用去心，可直接入藥;③遠(yuǎn)志生品有“戟人咽喉”的副作用，一般使用其

2、炮制品，如蜜制品和甘草制品，其臨床混用現(xiàn)象嚴(yán)重。由上可知，遠(yuǎn)志莖葉是否有利用價(jià)值，遠(yuǎn)志根初加工時(shí)是否應(yīng)抽去木心以及遠(yuǎn)志炮制品的科學(xué)性和臨床應(yīng)用這三大問題亟待解決。因此本論文對(duì)這些問題進(jìn)行探究，以期為遠(yuǎn)志質(zhì)量評(píng)價(jià)、資源利用和科學(xué)使用提供指導(dǎo)和依據(jù)。
　　目前遠(yuǎn)志質(zhì)量評(píng)價(jià)尚存在以下問題:①對(duì)遠(yuǎn)志不同部位（根和莖葉，筒和木心）以及不同炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)，多以有限成分為指標(biāo)或進(jìn)行簡(jiǎn)單的HPLC-UV指紋圖譜分析，無法對(duì)遠(yuǎn)志代謝組進(jìn)行全面系統(tǒng)

3、的評(píng)價(jià)，需要引入更加全面的分析手段;②對(duì)遠(yuǎn)志莖葉和根的化學(xué)成分差異研究較少，現(xiàn)有研究只對(duì)莖葉中多糖和皂苷含量進(jìn)行測(cè)定，并未對(duì)莖葉的化學(xué)成分進(jìn)行全面分析，且遠(yuǎn)志莖葉的藥理作用研究尚未見報(bào)道，這不利于莖葉的資源利用。③關(guān)于遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定，《中國(guó)藥典》2005版規(guī)定其對(duì)照品為皂苷酸水解產(chǎn)物遠(yuǎn)志酸，而2010版對(duì)照品則為皂苷堿水解產(chǎn)物細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷。本文選題時(shí)中國(guó)藥品生物制品檢定所還沒有細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品，因此有必要對(duì)其進(jìn)行分離制備。且目前還

4、沒有以細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)遠(yuǎn)志不同部位及不同炮制品中皂苷類含量進(jìn)行評(píng)價(jià)的研究。
　　目的:首先，采用NMR和UPLC植物代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合UPLC技術(shù)測(cè)定遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的含量測(cè)定方法，對(duì)遠(yuǎn)志不同部位（根和莖葉，筒和木心）及不同炮制品代謝組差異（本研究所涉及遠(yuǎn)志炮制品和生品均為遠(yuǎn)志筒）進(jìn)行分析，并尋找差異性代謝產(chǎn)物。其次，對(duì)遠(yuǎn)志莖葉進(jìn)行藥理作用研究。以期從整體角度對(duì)遠(yuǎn)志進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并對(duì)遠(yuǎn)志資源利用、炮制加工及臨床使用提供科學(xué)依

5、據(jù)和指導(dǎo)。
　　方法:1.建立遠(yuǎn)志NMR和UPLC植物代謝組學(xué)分析方法，并對(duì)遠(yuǎn)志不同部位及不同炮制品（筒）代謝組差異進(jìn)行分析。首先對(duì)遠(yuǎn)志不同樣品提取物進(jìn)行1H NMR和UPLC分析，對(duì)所得圖譜進(jìn)行代謝物指認(rèn)。其次采用相應(yīng)軟件對(duì)圖譜進(jìn)行預(yù)處理得到大量數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后，采用SIMCA-P軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和最小偏二乘法分析(PLS-DA)。最后根據(jù)分析結(jié)果，分析樣品代謝組差異，并尋找差異代謝產(chǎn)物。
　　2

6、.分離制備細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對(duì)照品，并采用UPLC技術(shù)對(duì)遠(yuǎn)志不同部位及不同炮制品（筒）中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量進(jìn)行測(cè)定。通過對(duì)細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量進(jìn)行比較，分析皂苷類成分含量在遠(yuǎn)志不同部位及不同炮制品（筒）中的差異。
　　3.采用小鼠懸尾、強(qiáng)迫游泳的抑郁模型及氨水引咳、氣管酚紅排泌的止咳祛痰模型對(duì)遠(yuǎn)志莖葉提取物的抗抑郁及止咳祛痰活性進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:1.NMR和UPLC植物代謝組學(xué)分析表明，遠(yuǎn)志不同部位及不同炮制品（筒）代謝組明顯不同。

7、
　　遠(yuǎn)志不同部位PCA分析結(jié)果表明，莖葉、根、筒和木心分別聚為一類，且根、筒和木心距離較近，說明莖葉與地下部分代謝組差異很大。與根相比，莖葉中部分初級(jí)代謝產(chǎn)物氨基酸類纈氨酸和谷氨酸，有機(jī)酸類如琥珀酸和γ-氨基丁酸等，以及次級(jí)代謝產(chǎn)物遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量較高，而蘇氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蔗糖和腺嘌呤以及3，6'-二芥子?；酋?、Sibiricose A5、Sibiricose A6、Tenuifoliside A、Tenuifolis

8、eⅠ、Tenuifolise H、遠(yuǎn)志口山酮Ⅳ、OnjisaponinA和Onjisaponin K等含量較低。同時(shí)，遠(yuǎn)志筒和木心代謝組也存在一定差異，與筒相比，木心中除氨基酸類成分丙氨酸和寡糖酯類TenuifoliseⅠ等外，多數(shù)代謝物含量都較低。
　　遠(yuǎn)志不同炮制品（筒）PCA分析結(jié)果表明，生品、蜜制品和甘草制品分別聚為一類，其代謝組各有不同，說明炮制會(huì)對(duì)生品代謝組產(chǎn)生一定影響，蜜制使生品中初級(jí)代謝產(chǎn)物甲酸和α-葡萄糖，次級(jí)代

9、謝產(chǎn)物TenuifoliseⅠ和Onjisaponin A含量升高，而蘇氨酸、丙氨酸、果糖和蔗糖以及3，6'-二芥子酰基糖酯、Tenuifoliside A、Tenuifolise H和遠(yuǎn)志口山酮Ⅳ含量降低;甘草制使生品中初級(jí)代謝產(chǎn)物亮氨酸和酒石酸，次級(jí)代謝產(chǎn)物TenuifoliseⅠ、Tenuifolise H及Onjisaponin K含量上升，而蘇氨酸、丙氨酸、琥珀酸、富馬酸和蔗糖以及3，6'-二芥子?；酋?、遠(yuǎn)志口山酮Ⅳ和Ten

10、uifolise H含量下降。同時(shí)，蜜制品和甘草制品代謝組之間也存在差異，與蜜制品相比，甘草制品中α-葡萄糖、甲酸和3，6'-二芥子?；酋ズ枯^低，說明不同炮制方法會(huì)對(duì)生品代謝組產(chǎn)生不同影響。
　　2.所分離得到的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷純度達(dá)到98％以上，可作為對(duì)照品使用。UPLC細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測(cè)定結(jié)果表明，遠(yuǎn)志不同部位及不同炮制品（筒）中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量不同。遠(yuǎn)志不同部位中，莖葉的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量遠(yuǎn)低于根;而且傳統(tǒng)要求抽去的木心中含量

11、遠(yuǎn)比筒低，含量差異具極顯著性，遠(yuǎn)志筒中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量比根高，含量差異具顯著性;遠(yuǎn)志不同炮制品（筒）中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量也不同，蜜遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量與生遠(yuǎn)志無顯著性差異，制遠(yuǎn)志含量則高于生遠(yuǎn)志，且含量差異具顯著性。
　　3.遠(yuǎn)志莖葉藥理作用研究表明，遠(yuǎn)志莖葉無抗抑郁作用，但具有一定的止咳祛痰活性，且止咳活性強(qiáng)于根，祛痰活性弱于根。
　　結(jié)論:本文成功建立了遠(yuǎn)志NMR和UPLC植物代謝組學(xué)分析方法以及遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷UPL

12、C含量測(cè)定方法，并對(duì)遠(yuǎn)志皂苷含量測(cè)定對(duì)照品細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷進(jìn)行分離制備，同時(shí)研究了莖葉的抗抑郁及止咳祛痰活性。研究結(jié)果表明:
　　1.遠(yuǎn)志莖葉和根代謝組明顯不同。與根相比，莖葉中部分初級(jí)代謝產(chǎn)物及遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量較高，皂苷含量較低。藥理研究表明莖葉具有止咳祛痰活性，且止咳活性比遠(yuǎn)志根強(qiáng)，祛痰活性則較弱，說明遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ可能是遠(yuǎn)志止咳活性有效成分，而皂苷類不是。莖葉具有一定的藥用價(jià)值，但其能否被利用，還有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
　　遠(yuǎn)志筒

13、和木心代謝組明顯不同。與筒相比，木心中除氨基酸類成分丙氨酸和寡糖酯類TenuifoliseⅠ等外，多數(shù)化合物，特別是皂苷類，含量都較低，說明傳統(tǒng)認(rèn)為遠(yuǎn)志根使用時(shí)應(yīng)抽去木心具有一定科學(xué)依據(jù)。
　　2.遠(yuǎn)志不同炮制品（筒）代謝組明顯不同。蜜制和甘草制對(duì)生品（筒）化學(xué)成分的改變不同，特別是皂苷類，蜜制使OnjisaponinA含量升高，但對(duì)總皂苷含量影響不大，說明遠(yuǎn)志中皂苷類成分較為復(fù)雜，單一成分并不能代表總皂苷含量變化。而甘草制則使皂