基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序與植物代謝組學(xué)技術(shù)研究遠志皂苷生物合成途徑.pdf

1、選題依據(jù):遠志皂苷作為遠志藥材中潛在的活性物質(zhì),已被證實具有益智安神、鎮(zhèn)靜祛痰及抗衰老等多種藥理活性,是遠志中重要的次生代謝產(chǎn)物。目前,對遠志皂苷的研究多集中于化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定、化合物分離和藥理活性等方面,對遠志分子生物學(xué)的研究較少,而有關(guān)遠志皂苷生物合成途徑研究更是缺乏,目前,主要存在以下兩個問題:(1).遠志功能基因數(shù)據(jù)庫缺乏,NCBI數(shù)據(jù)庫中關(guān)于遠志的mRNA僅5條(截止2014.02),與人參、丹參、三七等大量基因資源相比較,不能滿

2、足后續(xù)對遠志次生代謝產(chǎn)物生物合成通路的基礎(chǔ)研究。(2).遠志皂苷作為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類化合物的一種,從乙酰輔酶 A到角鯊烯這個上游代謝途徑比較清晰,其從角鯊烯環(huán)氧化酶(SQE)到最后三萜皂苷形成的下游代謝通路每個物種都有各自的規(guī)律,而有關(guān)遠志皂苷的代謝途徑及關(guān)鍵酶基因尚不清晰,無法為遠志皂苷含量的提高提供理論基礎(chǔ);因此,本論文對這些問題進行探究,以期能完善遠志酶基因數(shù)據(jù)庫,并更好了解遠志皂苷合成途徑,從而為其在遠志中的基因調(diào)控和遺

3、傳轉(zhuǎn)化提供數(shù)據(jù)支持。
　　目的:1.基于高通量測序技術(shù)進行遠志轉(zhuǎn)錄組研究,豐富遠志的基因資源。2.基于轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫,篩選出遠志合適的內(nèi)參基因,為熒光定量 PCR技術(shù)(qRT-PCR)技術(shù)在遠志基因差異表達研究奠定基礎(chǔ)。3.通過植物代謝組學(xué)技術(shù)和 qRT-PCR技術(shù)結(jié)合,結(jié)合遠志三萜皂苷峰強度與遠志皂苷合成途徑中酶基因表達高低的相關(guān)性,找到在遠志不同部位遠志皂苷合成途徑中差異表達的功能基因,為今后通過生物工程調(diào)控遠志皂苷含量奠定基礎(chǔ)。

4、
　　方法:1.應(yīng)用 Illumina高通量測序技術(shù)對遠志根組織進行轉(zhuǎn)錄組測序,并通過生物信息學(xué)分析,獲得大量遠志基因信息。
　　2.采用實驗室前期建立的超高效液相色譜(UPLC)分析方法對不同部位、不同年限及不同產(chǎn)地的遠志進行UPLC圖譜分析,初步分析皂苷含量差異,篩選下一步研究對象。
　　3.基于超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF MS)代謝組學(xué)技術(shù),對遠志不同部位進行代謝組學(xué)研

5、究,指認并分析了遠志皂苷類化合物在不同部位的含量差異。
　　4.采用qRT-PCR技術(shù),基于先前轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,篩選遠志內(nèi)參基因,并采用2-ΔΔCT法對涉及遠志皂苷生物合成途徑的15種基因在遠志不同部位表達水平進行分析;結(jié)合皂苷合成途徑中酶基因表達與UPLC/Q-TOF MS分析皂苷峰強度的相關(guān)性來闡述造成不同部位間遠志次生代謝差異的分子機理。
　　結(jié)果:1.本研究對遠志的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計和組裝統(tǒng)計,結(jié)果得到11547

6、7條Unigenes,總長149 Mb;通過分別與NCBI的Nt、Nr、Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫、COG數(shù)據(jù)庫及 KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對,對Unigenes進行了功能比對和注釋。
　　2.基于UPLC技術(shù)對遠志不同年限、部位和產(chǎn)地進行篩選,研究結(jié)果表明,遠志不同部位318nm波長下的UPLC指紋圖譜的相似度明顯小于不同產(chǎn)地和不同年限,且通過文獻比對初步指認結(jié)果,篩選出遠志不同部位的遠志皂苷含量差異最大。
　　3.通過

7、UPLC/Q-TOF MS化合物指認,共鑒定出25個化合物,其中包括4個遠志口山酮類化合物,6個蔗糖酯類化合物,8個寡糖酯類化合物及7個三萜皂苷類化合物,通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)遠志不同部位的22個代謝差異物,除Lancerin和7-O-Methylmangiferin外,其他化合物均在根中含量最高,且統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)莖、葉和種子中的7個三萜皂苷類化合物與根比較均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　4.基于先前遠志轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,采用q

8、RT-PCR技術(shù),篩選了18s RNA,UBC2,ACT11,GAPDH,TUA,ACT1和EF1a等常用的7個內(nèi)參基因,根據(jù)GeNorm軟件和NormFinder軟件計算結(jié)果,發(fā)現(xiàn)GAPDH基因在遠志不同部位中最為穩(wěn)定;以GAPDH作為遠志內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法對遠志皂苷生物合成途徑涉及的15種基因在遠志不同部位表達水平進行了分析,通過遠志三萜皂苷峰強度與遠志皂苷合成途徑中酶基因表達的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)三萜皂苷骨架合成途徑中,鯊烯合成

9、酶(Squalene synthase,SQS)、鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase,SQE))和β-香樹脂合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)與各組織三萜皂苷中分布相關(guān)性最大,對比推測的6個CYP450和UGT酶在不同組織中的表達情況,與三萜皂苷在不同組織的分布相關(guān)性不明顯。
　　結(jié)論:本研究對遠志轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行了組裝統(tǒng)計和生物信息學(xué)分析,獲得大量遠志基因信息,基于遠志轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出GAP