泥蚶Smad1-5、BMP2-4基因的克隆、表達(dá)分析及生長性狀相關(guān)SNP位點(diǎn)篩選.pdf

1、泥蚶（Tegillarca granosa）是我國四大傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，深受沿海地區(qū)居民的喜愛。但是目前，對包括泥蚶在內(nèi)的軟體動物的生長調(diào)控機(jī)制尚不清楚，進(jìn)而制約了高效率的快速生長性狀定向培育優(yōu)良品種的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)研發(fā)進(jìn)程。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)性的多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、分化和生長等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。該超

2、家族中具有眾多生長相關(guān)功能基因，本研究就對其中的Smad1/5基因和BMP2/4基因在泥蚶中的作用機(jī)制展開了探究，以期為泥蚶分子標(biāo)記輔助育種（molecular marker-assisted selection，MAS）提供理論基礎(chǔ)，使育種更具針對性，縮短泥蚶育種周期，降低育種成本，改進(jìn)傳統(tǒng)選育技術(shù)，大力發(fā)展泥蚶健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。研究結(jié)果如下：
　　1.獲得Smad1/5基因的cDNA全長、基因組結(jié)構(gòu)及其時(shí)空表達(dá)特征。利用RACE方

3、法克隆得到泥蚶Smad1/5基因（Tg-Smad1/5）的cDNA全長序列（GenBank登錄號：KP250873），該序列全長2424bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）有1386bp，編碼462個氨基酸。Tg-Smad1/5蛋白與雙殼貝類中合浦珠母貝（Pinctada fucata）、太平洋牡蠣（Crassostreagigas）的同源性分別達(dá)到了92.3％、91.2%。在cDNA序列基礎(chǔ)上，利用普通PC

4、R方法克隆獲得了Tg-Smad1/5基因的3個內(nèi)含子，大小分別為504bp，553bp，874bp，均屬于GT-AG-內(nèi)含子。利用染色體步移（genome walking）技術(shù)克隆得到泥蚶Smad1/5基因啟動子序列，該片段長從5’末端到起始密碼子ATG的長度為934bp，包含GATA框、八聚體轉(zhuǎn)錄因子（Oct-1）等結(jié)構(gòu)，符合啟動子序列特征。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quanititativ

5、e PCR，qRT-PCR）技術(shù)，研究了Smad1/5基因在泥蚶6個組織和9個發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Tg-Smad1/5基因在泥蚶成貝6個組織中均有表達(dá)，而在斧足中的表達(dá)量最高，極顯著地高于其他組織；在各發(fā)育時(shí)期中，Tg-Smad1/5表達(dá)量隨發(fā)育進(jìn)程呈逐漸升高的趨勢，在眼點(diǎn)幼蟲期達(dá)到最高，極顯著高于其他時(shí)期，而在變態(tài)至稚貝時(shí)，表達(dá)量又極顯著地下降。研究結(jié)果表明，Tg-Smad1/5具有類似于高等動物的分子結(jié)構(gòu)，并在泥蚶不同組

6、織、不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)有所差異，這為進(jìn)一步研究該基因在貝類中的功能和作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　2. BMP2/4基因的擴(kuò)增及其時(shí)空表達(dá)特征的研究。利用 SMART RACE技術(shù)克隆泥蚶BMP2/4基因（Tg-BMP2/4）的cDNA全長，最終得到1583bp的cDNA片段，開放閱讀框有896bp，編碼298個氨基酸。Tg-BMP2/4與其他物種的同源性不高，與同是貝類的太平洋牡蠣、櫛孔扇貝同源性也僅有53%和52%。運(yùn)用qRT-

7、PCR技術(shù)對Tg-BMP2/4基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Tg-BMP2/4基因在泥蚶成貝6個組織中均有表達(dá)，而在鰓、外套膜和斧足中的表達(dá)量都較高，極顯著地高于血液、閉殼肌和內(nèi)臟團(tuán)組織；在各發(fā)育時(shí)期中，Tg-BMP2/4表達(dá)量在眼D形幼蟲和稚貝時(shí)期較高，稚貝時(shí)則達(dá)到最高值，極顯著高于其他時(shí)期。本研究結(jié)果表明，Tg-BMP2/4在泥蚶不同組織、不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)差異顯著，其可能參與泥蚶的器官組織發(fā)生和殼的生長。這為進(jìn)一步研究BMP2/

8、4基因在貝類中的功能和作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　3. Smad1/5基因與生長性狀相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選。隨機(jī)選取10個泥蚶個體，通過對已知序列進(jìn)行直接測序，獲得候選SNP位點(diǎn)78個。SNP密度為平均每1SNP/43bp，其中外顯子區(qū)域密度為1SNP/198bp，內(nèi)含子區(qū)域密度為1SNP/28bp。位點(diǎn)突變類型比例分別為：轉(zhuǎn)換34.62%，顛換28.21%，插入/缺失37.18%。編碼區(qū)的7個SNP均為轉(zhuǎn)換類型且包括5個同義突變