益生菌的黏附及免疫調(diào)節(jié)機(jī)理的初步研究.pdf

1、黏附能力是益生菌發(fā)揮有益作用的先決條件，也是評(píng)價(jià)益生菌功能的重要指標(biāo)之一，研究益生菌的黏附對(duì)認(rèn)識(shí)微生態(tài)學(xué)的基本規(guī)律有著重要意義。益生菌對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及作用機(jī)制也是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。本論文以牙鲆和大菱鲆為研究對(duì)象，探討了益生菌對(duì)上述兩種魚(yú)類腸黏液的黏附特性，并從Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑初步探討了益生菌調(diào)節(jié)牙鲆免疫功能的分子機(jī)理。研究?jī)?nèi)容分為兩部分，第一部分主要研究益生菌黏附特性，包括黏附檢測(cè)方法的建立，高黏附性能菌株的篩選，

2、表面黏附蛋白及腸黏液受體的鑒定及益生菌的腸道定植能力分析；第二部分主要研究高黏附能力益生菌(鼠李糖乳桿菌)通過(guò)Toll樣受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑調(diào)節(jié)牙鲆機(jī)體免疫功能的分子機(jī)理。 1.MTT比色法測(cè)定微生物黏附能力的條件優(yōu)化：對(duì)MTT比色法測(cè)定微生物數(shù)量的多種影響因素進(jìn)行優(yōu)化，以期建立穩(wěn)定的反應(yīng)體系，并以該方法測(cè)定微生物的黏附能力。試驗(yàn)比較了DMSO、HCl-Isopropanol、DMSO-SDS、DMF-SDS四種溶劑對(duì)甲躦顆粒(F

3、MZ)的溶解效果以及在上述溶劑中FMZ的吸收光譜特性，分析了MTT與微生物作用時(shí)間對(duì)光吸收值的影響。最后利用優(yōu)化的MTT比色法測(cè)定黏紅酵母、鼠李糖乳桿菌及納豆芽孢桿菌的活菌數(shù)量。結(jié)果，SDS-DMF溶劑對(duì)FMZ的溶解效果最好，在570nm波長(zhǎng)有較大吸收值，MTT與微生物的孵育時(shí)間以2h為宜。在一定的濃度范圍內(nèi)，上述三種微生物的活菌數(shù)量與FMZ的OD值存在良好的線性關(guān)系。其中納豆芽孢桿菌在6.30×106～2.02×108 cfu·ml-

4、1范圍內(nèi)，活菌數(shù)量與FMZ的吸光度值呈良好相關(guān)性(R2=0.9981 )，鼠李糖乳桿菌和黏紅酵母的線性范圍分別為5.40×106～1.73x108 cfu·ml-1 (R2=0.9899 )、1.51×106～0.98×108cfu·ml-1 (R2=0.9921)。 2.不同益生菌株對(duì)牙鲆及大菱鲆腸黏液黏附能力的比較：采用MTT比色法測(cè)定鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、黏紅酵母和假絲酵母對(duì)牙鲆和大菱鲆腸黏

5、液的黏附情況，獲得對(duì)牙鲆和大菱鲆腸黏液具較強(qiáng)黏附能力的菌株，為后續(xù)的試驗(yàn)提供試驗(yàn)菌株。以碳烴化合物黏著法測(cè)定上述菌株的表面疏水性，以明確黏附能力與菌體表面疏水之間的相互關(guān)系。結(jié)果表明所有菌株均可黏附于牙鲆和大菱鲆腸黏液，黏附百分率在4％～25％之間。黏附能力由強(qiáng)到弱依次為：黏紅酵母>鼠李糖乳桿菌>假絲酵母>嗜酸乳桿菌>枯草芽孢桿菌>納豆芽孢桿菌。同一菌株對(duì)兩種腸黏液的黏附能力無(wú)明顯差別；但不同菌株對(duì)腸黏液的黏附能力則存在較大的差異。各菌

6、株表面疏水性存在較大差異，其中黏紅酵母表面疏水性最強(qiáng)；嗜酸乳桿菌疏水性最弱，枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌及鼠李糖乳桿菌的表面疏水性處于中間水平。所測(cè)試的6株益生菌的表面疏水性與其黏液黏附能力之間無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論，黏紅酵母和鼠李糖乳桿菌對(duì)牙鲆及大菱鲆腸黏液都具有較強(qiáng)黏附能力，這種黏附能力具有種屬特異性，受宿主黏液影響較小。 3.黏紅酵母黏附牙鲆腸黏液的影響因子研究：采用MTT比色法研究了pH、溫度、二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)黏紅酵母黏附作用的影

7、響以及不同生長(zhǎng)階段的黏紅酵母對(duì)牙鲆黏液的黏附特點(diǎn)。結(jié)果顯示，在10～30℃黏紅酵母對(duì)牙鲆腸黏液的黏附隨溫度升高而增強(qiáng)，中性偏酸的環(huán)境有利于黏紅酵母的黏附；Ca2+能顯著增加黏紅酵母的黏附，但Mg2+促黏附作用不明顯；處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黏紅酵母對(duì)牙鲆腸黏液的黏附能力最強(qiáng)，其次是延滯期的酵母，而穩(wěn)定期和衰亡期的黏紅酵母黏附能力顯著減弱。上述結(jié)果說(shuō)明黏紅酵母對(duì)牙鲆腸黏液的黏附作用不僅受多種環(huán)境因子的影響，也受其自身生理狀態(tài)的影響，其黏附作用具有

8、可控性，這對(duì)黏紅酵母在牙鲆腸道內(nèi)黏附、定植的調(diào)控有一定的參考價(jià)值。 4.黏紅酵母和鼠李糖乳桿菌在牙鲆腸道的定植：將上述兩種益生菌添加到基礎(chǔ)飼料中連續(xù)投喂牙鲆21d，然后改投基礎(chǔ)飼料繼續(xù)飼養(yǎng)14 d(試驗(yàn)組)，對(duì)照組一直投喂基礎(chǔ)飼料。分別于試驗(yàn)的第0、7、14、21、28、35d取樣測(cè)定牙鲆腸道弧菌、乳酸菌及酵母數(shù)量，計(jì)算對(duì)照組與試驗(yàn)組牙鲆的成活率。結(jié)果表明，前21d試驗(yàn)組牙鲆腸道黏紅酵母數(shù)量達(dá)到了104 cfu·g-1，乳酸菌數(shù)

9、量達(dá)到106cfu·g-1，顯著高于對(duì)照組；試驗(yàn)組牙鲆腸道弧菌總數(shù)隨黏紅酵母及鼠李糖乳桿菌的增加而減少，并顯著低于對(duì)照組。改投基礎(chǔ)飼料后，試驗(yàn)組牙鲆腸道兩種益生菌在腸道中的數(shù)量明顯減少，但仍高于對(duì)照組；弧菌總數(shù)有所增加，但顯著低于對(duì)照組。試驗(yàn)組牙鲆成活率高于對(duì)照組。結(jié)論：黏紅酵母和鼠李糖乳桿菌能夠在牙鲆腸道定植，并能降低牙鲆腸道弧菌總數(shù)，降低牙鲆死亡率。因此具有較好的應(yīng)用前景。 5.黏紅酵母表面黏附相關(guān)蛋白及黏液受體的初步研究：

10、前期的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黏紅酵母對(duì)大菱鲆腸黏液具有較強(qiáng)黏附能力，為進(jìn)一步了解其黏附機(jī)制。采用Western-blot技術(shù)，對(duì)黏紅酵母表面黏附蛋白和腸黏液受體進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，黏紅酵母表面蛋白預(yù)先與腸黏液孵育2h后，顯著抑制了黏紅酵母與腸黏液的結(jié)合，其黏附百分率下降了83.6％；Western-blot顯示黏紅酵母表面蛋白中分子量為38.5 ku和28.6 ku的兩個(gè)蛋白參與對(duì)腸黏液的黏附過(guò)程，大菱鲆腸黏液中分子量為27.3 ku和22.3

11、 ku兩個(gè)蛋白可與黏紅酵母表面蛋白特異性結(jié)合。糖原染色顯示上述四個(gè)蛋白均為糖蛋白。 6.鼠李糖乳桿菌通過(guò)Toll樣受體信號(hào)途徑誘導(dǎo)牙鲆天然免疫反應(yīng)：為闡明Toll樣受體信號(hào)途徑在鼠李糖乳桿菌誘導(dǎo)牙鲆天然免疫反應(yīng)中的作用，將鼠李糖乳桿菌和牙鲆巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)2h，然后用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR法分析巨噬細(xì)胞Toll樣受體(TLR2、TLR22)及腫瘤壞死因子(TNF-α) mRNA的表達(dá)情況，用凝膠阻滯電泳測(cè)定核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化

12、狀態(tài)。結(jié)果表明巨噬細(xì)胞經(jīng)鼠李糖乳桿菌刺激后TLR22，TLR2及TNF-α mRNA表達(dá)量顯著增加，凝膠阻滯試驗(yàn)也證實(shí)鼠李糖乳桿菌刺激后巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶(ERK)，p38MAPK及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在鼠李糖乳桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TLR2、TLR22和TNF-α mRNA表達(dá)中的作用，巨噬細(xì)胞先用ERK、p38MAPK及NF-κB特異性抑制劑PD98058，SB203508和BAY11-7082

13、分別預(yù)處理1h，然后再與鼠李糖乳桿菌共培養(yǎng)2h。結(jié)果顯示p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理巨噬細(xì)胞1h后，顯著抑制了巨噬細(xì)胞TLR22,TLR2及TNF-α mRNA的表達(dá)。抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也顯著降低了TNF-α的表達(dá)，但是不能抑制巨噬細(xì)胞TLR22、TLR2 mRNA的表達(dá)。綜上所述，鼠李糖乳桿菌可能通過(guò)TLR22、TLR2介導(dǎo)的信號(hào)途徑誘導(dǎo)TNF-α mRNA的表達(dá)，從而起始牙鲆天然免疫反應(yīng)，而p38MAPK信號(hào)途徑