貴州省仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)基因分析.pdf

1、2010年以來，貴州省部分地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場豬群出現(xiàn)不同程度的腹瀉，部分養(yǎng)豬場采用豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行緊急免疫，但效果甚微。為弄清仔豬病毒性腹瀉在貴州省的流行情況，筆者主要開展了仔豬病毒性腹瀉病原快速檢測方法的建立、貴州省仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)基因分析的研究，研究結(jié)果為貴州省仔豬病毒性腹瀉的診斷、治療和疫苗研究提供重要依據(jù)。
　　1．PEDV、TGEV和RV RT-PCR檢測方法的建立與臨床應(yīng)用：本

2、研究根據(jù)Genbank提供的PEDV、TGEV和RV基因參考序列，設(shè)計(jì)三對特異性引物，以PEDV-TGEV-RV三聯(lián)疫苗RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，分別建立PEDV、TGEV和RV RT-PCR檢測方法，并對其進(jìn)行了反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果顯示，PEDV、TGEV和RV擴(kuò)增長度分別為651bp、859bp、309bp，與預(yù)期大小相符；PEDV、TGEV和RV RT-PCR反應(yīng)體系最佳退火溫度均為53℃，最適引物濃度為10 nmol/μL；P

3、EDV、TGEV和RV最低cDNA模板檢出濃度分別為1.28×10-8g/L，0.36×10-7g/L，2.6×10-9 g/L，特異性、敏感性良好，能夠用于臨床檢測。
　　2．貴州省仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查：
　　(1)采用常規(guī)流行病學(xué)方法對貴州省部分規(guī)模化養(yǎng)豬場進(jìn)行仔豬病毒性腹瀉發(fā)病狀況調(diào)查、免疫狀況調(diào)查、臨床癥狀與大體病變觀察。結(jié)果表明，2013年~2014年的5個(gè)州(市)13個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場，豬群發(fā)生腹瀉性疾病多在12

4、月至翌年5月，發(fā)病率為70.35％（3020/4293），病死率為76.16%（2300/3020）。
　　(2)用ELISA方法對貴州省2013~2014年收集的7個(gè)地州(市)20個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場184份血清樣本進(jìn)行PEDV、TGEV和RV抗體檢測。結(jié)果顯示： PEDV、TGEV和RV血清總體陽性率分別為39.13%、33.70%和42.39%；PEDV、TGEV和RV免疫抗體陽性率分別為44.05%、32.14%、46.43%；未

5、免疫豬群PEDV、TGEV和RV抗體陽性率為35.00%、35.00%、39.00%。
　　(3)采用RT-PCR方法對111份臨床疑似病毒性腹瀉樣本進(jìn)行PEDV、TGEV和RV病原核酸檢測。結(jié)果顯示：PEDV、TGEV和RV的核酸檢出率分別為82.88%(92/111)、1.80%(2/111)和10.81%(12/111)；PEDV與 TGEV混合感染陽性率為0.02%(2/111)， PEDV與 RV混合感染陽性率為10.8

6、1%(12/111)。以上結(jié)果說明，我省養(yǎng)殖場存在PEDV、TGEV和RV隱性感染的情況。
　　3．豬流行性腹瀉病毒(PEDV)分子流行病學(xué)調(diào)查：參考GenBank登錄的PEDV比利時(shí)毒株CV777株(NO.AF353511)基因序列，針對S、M和ORF3基因設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR方法，擴(kuò)增目的基因，并進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序分析，并利用DNAStar、MEGA5.0軟件對貴州省地方流行株S、M和ORF3的基因序列進(jìn)行

7、遺傳演化分析。結(jié)果顯示，本研究成功克隆6株毒株的S、M和ORF3基因，遺傳變異分析如下：
　　(1)6株貴州地方流行株S基因的全長為均為4161bp，編碼1387個(gè)氨基酸，核苷酸與氨基酸同源性分別在98.0%~99.1%和97.3%~100%之間；與國內(nèi)外PEDV參考毒株核苷酸同源性在91.8%~93.9%之間，氨基酸同源性在91.3%~99.3%之間。與參考毒株CV777相比，6株地方流行株S基因存在420個(gè)堿基突變，在175~

8、186,417~419共有15個(gè)堿基的插入，在481位~486位共同缺失5個(gè)堿基。
　　(2)6株地方流行株M基因全長均為681bp，編碼226個(gè)氨基酸；核苷酸與氨基酸之間的同源性分別在99.9%~100%和97.8%~99.6%之間；與國內(nèi)外的PEDV參考毒株核苷酸的同源性在97.8%~98.2%之間，氨基酸同源性在97.8%~98.2%之間。M基因的核苷酸序列出現(xiàn)部分點(diǎn)突變，無插入和缺失，氨基酸序列無變化，說明M基因保守性高。

9、
　　(3)6株地方流行株ORF3基因全長為675bp，編碼225個(gè)氨基酸，核苷酸與氨基酸之間的同源性分別在99.0%~100%和98.2%~99.6%之間；與國內(nèi)外的毒株核苷酸的同源性在96.1%~98.5%之間，氨基酸同源性在95.6%~99.1%之間。與CV777毒株序列相比，流行毒株ORF3基因存在29處點(diǎn)突變，無堿基的缺失和插入。進(jìn)化樹分析，6株流行毒株與CV777株、美國毒株和韓國毒株親緣關(guān)系較近，與LZC、Brl/8

10、7親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　結(jié)論：
　　1.本試驗(yàn)成功建立了PEDV、TGEV和RV的RT-PCR檢測方法，敏感性高、特異性好能夠用于臨床診斷。
　　2.經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，貴州省部分規(guī)模養(yǎng)豬場存在不同程度豬病毒性腹瀉感染，且主要病原為PEDV；血清學(xué)調(diào)查表明貴州省豬群腹瀉疫病的免疫效果較差，存在隱性感染的情況。
　　3.對PEDV病毒S、M和ORF3三個(gè)基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，貴州省PEDV地方流行株分為兩群，與