IL-2錨定的Exosomes的制備及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)殺傷效應(yīng)的研究.pdf

1、目的:為提高exosomes的免疫原性,制備白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)錨定的膀胱移行細(xì)胞癌(transitional cell carcinomaof bladder,TCCB)T24細(xì)胞來(lái)源的exosomes(Ex/GPI-IL-2)疫苗,研究其電鏡形態(tài)、免疫分子組成及體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL)殺傷T24細(xì)胞的效應(yīng),為膀胱移行細(xì)胞癌的免疫治療提供理論基礎(chǔ)

2、。
　　 方法:1.通過(guò)基因合成技術(shù)將糖基化磷脂酰肌醇(GPI)信號(hào)肽序列與人IL-2基因拼接成融合基因,構(gòu)建pEGFP-N1-IL2gpi質(zhì)粒。膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和G418篩選后,分別建立穩(wěn)定表達(dá)GPI-IL-2融合蛋白和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的細(xì)胞株T24/GPI-IL-2和T24/p,通過(guò)免疫熒光顯微技術(shù)和ELISA檢測(cè)IL-2錨定蛋白的表達(dá)；2.收集T2

3、4/GPI-IL-2、T24/p和T2448h細(xì)胞培養(yǎng)液,采用超速和蔗糖梯度密度離心法提取exosomes(EX/GPI-IL-2、Ex/p和Ex),用電鏡負(fù)染技術(shù)進(jìn)行形態(tài)觀察,Western blot和ELISA方法進(jìn)行分子標(biāo)志檢測(cè)；3采用密度梯度離心法從正常人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞,利用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant humangranulocyte macrophage colony stimulating fac

4、tor,GM-CSF)和重組人白細(xì)胞介素-4(recombinant human interleukin-4,IL-4)細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng),誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞形成,倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察其形態(tài)。從外周血中分離T淋巴細(xì)胞,通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)負(fù)載Ex/GPI-IL-2的DCs誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增值效應(yīng),通過(guò)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)負(fù)載Ex/GPI-IL-2的DCs誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對(duì)膀胱癌

5、細(xì)胞T24、BIU-87和腎癌細(xì)胞RC-2細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　 結(jié)果:1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL2gpi,經(jīng)過(guò)酶切和DNA測(cè)序鑒定與預(yù)期結(jié)果一致,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染和篩選后的細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)GPI-IL-2蛋白和綠色熒光蛋白；2.通過(guò)超速和蔗糖梯度密度離心法,分別從T24/GPI-IL-2、T24/p和T24細(xì)胞培養(yǎng)液中成功的提取了Ex/GPI-IL-2、Ex/p和Ex,均為直徑約30～90nm的類圓碟形小囊泡,均表達(dá)細(xì)胞

6、間粘附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSPT0)和黑色素瘤相關(guān)抗原A1(melanoma antigen family A member-1,MAGE-1)等,三種蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯的差異,通過(guò)ELISA檢測(cè)到基因GPI-IL-2修飾的T24細(xì)胞來(lái)源的exosomes表達(dá)錨定狀態(tài)的IL-2；3.外周血單個(gè)核細(xì)胞中的貼壁細(xì)

7、胞在細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4的作用下,誘導(dǎo)出具有典型樹枝狀突起的DCs細(xì)胞。Ex/GPI-IL-2、Ex/p和Ex經(jīng)過(guò)DCs細(xì)胞負(fù)載后,誘導(dǎo)T細(xì)胞的增值指數(shù)分別為2.78±0.25,1.94±0.32和1.92±0.28,分別活化的CTL在效靶比為50:1時(shí),對(duì)T24細(xì)胞的殺傷率分別為:53.01±2.25％,37.22±2.49％和37.85±1.57％,相應(yīng)的CTL釋放的INF-γ分別為:1054.82±35.20pg/ml,

8、678.02±17.97pg/ml,和683.23±13.99pg/ml,Ex/GPI-IL-2活化的CTL對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24、BIU-87和腎癌細(xì)胞RC-2的殺傷率分別為:53.01±2.25％、46.61±2.60％、31.38±2.33％。
　　 結(jié)論:膀胱移行細(xì)胞癌T24可以向細(xì)胞外釋放exosomes,含有腫瘤抗原MAGE-1和免疫相關(guān)蛋白HSP70、ICAM-1等；通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù),可以將IL-2錨定到T24細(xì)胞來(lái)源