羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng)相關(guān)的Kaza1型蛋白酶抑制劑（MRPINK）的生物學(xué)功能研究.pdf

1、Kazal型蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族,廣泛分布在大多數(shù)的生物體中,參與調(diào)節(jié)生物的免疫防御,血液凝集和纖維蛋白水解,以及發(fā)育,生殖等生理過程。目前已有大量的Kazal型蛋白酶抑制劑被分離純化,它們的結(jié)構(gòu)和功能被報(bào)道。研究表明,典型的Kazal型結(jié)構(gòu)域由50-60個(gè)氨基酸殘基組成,其中六個(gè)半胱氨酸殘基,以1-5/2-4/3-6的模式形成三對(duì)二硫鍵。在第二個(gè)半胱氨酸殘基之后的第二個(gè)氨基酸位點(diǎn)被稱為P1位點(diǎn),此氨基酸則被稱為P1殘

2、基。這一家族的蛋白酶抑制劑在空間結(jié)構(gòu)上具有顯著的特點(diǎn),由一個(gè)緊密的支架和一個(gè)呈球狀突起的結(jié)合環(huán)構(gòu)成。P1氨基酸殘基和結(jié)合環(huán)在很大程度上決定著抑制劑的抑制特性。Kazal型蛋白酶抑制劑的抑制機(jī)理屬于“標(biāo)準(zhǔn)型作用機(jī)理”,當(dāng)抑制劑和蛋白酶相互作用時(shí),P1殘基插入到蛋白酶的活性位點(diǎn),結(jié)合環(huán)上的其他殘基則通過不同的分子作用力影響兩者結(jié)合。 在我們實(shí)驗(yàn)室原先的研究中,一種雄性生殖道相關(guān)的蛋白酶抑制劑(MRPINK)基因從羅氏沼蝦中被克隆出來

3、。該基因包含405bp的編碼區(qū),由21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和113個(gè)氨基酸的成熟肽鏈組成,構(gòu)成兩個(gè)Kazal型結(jié)構(gòu)域。其特異性地在雄性生殖道中表達(dá),并且被具體定位在生殖道中的分泌型上皮細(xì)胞。 在本研究中,我們對(duì)MRPINK和它的幾個(gè)突變體成功地進(jìn)行了原核表達(dá),檢測(cè)了它們對(duì)三種絲氨酸蛋白酶的抑制活性,分析了MRPINK的抑制特征和抑制機(jī)理,以及MRPINK兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和P1氨基酸殘基對(duì)抑制劑活性的影響。同時(shí)我們還研究了MRPINK對(duì)羅氏

4、沼蝦精子活性的影響,以闡述這個(gè)抑制劑分子的生理功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.MRPINK和針對(duì)P1位點(diǎn)構(gòu)建的幾個(gè)突變體(MRPINK137K,MRPINKL37A,MRPINKL37G,MRPINKP881)通過pET-28a(+)載體被成功地在大腸桿菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)；同時(shí)MRPINK的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域domain1和domain2通過pET-32a(+)載體也被在大腸桿菌中成功地誘導(dǎo)表達(dá)。其中rMRPINK,rMRPINKL37K,r

5、MRPINK37A,rMRPINKL37G,和rMRPINKP881以包涵體的形式被表達(dá)；而domain1和domain2則以可溶性的形式被表達(dá)。根據(jù)不同的性質(zhì),這些重組蛋白通過Ni-NTA,分別在變性條件和非變性條件下被分離純化。 2.通過分析重組蛋白對(duì)三種蛋白酶(Trypsin,Chymotrypsin,Thrombin)的抑制活性,表明MRPINK特異性地抑制chymotrypsin的活性,而對(duì)其它的兩種蛋白酶沒有抑制作用

6、。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),MRPINK對(duì)chymotrypsin是一種典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,抑制常數(shù)K1為354nM。其中domain2是具有抑制功能的結(jié)構(gòu)域,抑制常數(shù)K1為416nM。P1 Pro對(duì)domain2的抑制活性發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。而對(duì)于domainl來說,不管P1位點(diǎn)為L(zhǎng)eu,Lys,Ala或者是Gly均沒有表現(xiàn)出抑制活性。 3.我們進(jìn)一步研究了rMRPINK對(duì)羅氏沼蝦精子活性的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)精子提取物對(duì)卵膜蛋白的水解作用能夠

7、被MRPINK所抑制；明膠薄層(gelatinsubstrate film)分析顯示,MRPINK對(duì)羅氏沼蝦精子的水解明膠活性具有明顯的抑制作用；通過免疫熒光分析揭示,MRPINK特異性地結(jié)合在精子的基體(base)邊緣部位。 4.我們將羅氏沼蝦精子上的一種能夠被MRPINK特異性抑制的類明膠酶命名為羅氏沼蝦精子明膠酶(MSG,M.roseabergii sperm gelatinase)。應(yīng)用HPLC(reversed-pha

8、se high performance liquid chroma tography)和明膠-SDS-PAGE分析,MSG被分離純化。通過氨基末端氨基酸測(cè)序分析和分子克隆,MSG的cDNA序列被揭示。Northern blotting結(jié)果表明,MSG在羅氏沼蝦雄性生殖道中特異性地表達(dá)。原位雜交(ISH)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,MSG在羅氏沼蝦的輸精管和壺腹上皮分泌型細(xì)胞中表達(dá)。 結(jié)果表明,MRPINK競(jìng)爭(zhēng)性地抑制chymotrypsin