KLF6基因在肝癌中遺傳不穩(wěn)定性及臨床病理關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景：
　　 腫瘤(Tumor)是機體在各種致癌因素作用下,局部組織的某一個細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控,導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物。一般認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞是單克隆性的,即一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。所有的惡性腫瘤總稱為癌癥(cancer)[1]。癌癥是全球?qū)е滤劳龅闹饕驗橹?；世界衛(wèi)生組織2010年2月警告說,如果人們不認(rèn)真采取措施預(yù)防癌癥,到2030年全球每年的癌癥死亡人數(shù)將可能在現(xiàn)有基礎(chǔ)上翻番,達1

2、700萬。目前全球平均每8個死亡病例中就有1人死于癌癥,這比艾滋病、結(jié)核病和瘧疾導(dǎo)致的死亡人數(shù)總和還要高。而且,每年全球還有超過1200萬人被確診患上癌癥。新發(fā)癌癥中,男性789620例,前三位是前列腺癌(28％)、肺癌(15％)和直腸癌(9％),女性739940例,前三位是乳腺癌(28％),肺癌(14％)和直腸癌(10％)。癌癥是一種多步驟過程的結(jié)果,主要是由控制細(xì)胞生長的主要基因先后累積突變導(dǎo)致的[2]。遺傳不穩(wěn)定性在人類癌癥發(fā)展史

3、上占據(jù)著核心作用。由于正常的體細(xì)胞突變率極低,人們一致認(rèn)為,基因的遺傳不穩(wěn)定性伴隨基因突變率增加是癌癥發(fā)生的基礎(chǔ)[3]。因此,研究腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移機制為臨床提供可靠的治療及預(yù)后指標(biāo)。
　　 研究表明,原癌基因的激活和抑癌基因的失活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的兩個重要因素,尤其是抑癌基因的失活與腫瘤發(fā)生的關(guān)系更為密切[4]。腫瘤抑癌基因(tumorsuppressor gene,TSG)又稱隱性癌基因,需等位基因兩個位點均發(fā)生突變或缺失才會發(fā)

4、生功能障礙,即隱性純合或雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)時才會導(dǎo)致癌的發(fā)生[5]。抑癌基因變異最常見的分子機制是其2個位點相繼因點突變和LOH而導(dǎo)致功能完全喪失,即廣為接受的Knudsen“兩次打擊理論”[6]。大量研究顯示基因的遺傳不穩(wěn)定性,即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstablility,MSI)和LOH,可能是使抑癌基因失活的重要因素,由此導(dǎo)致基因突變和腫瘤的發(fā)生.
　

5、　 微衛(wèi)星是20世紀(jì)80年代后期分離出來一種比小衛(wèi)星DNA具有更短重復(fù)單元的衛(wèi)星DNA,又被稱作短串連重復(fù)或簡單重復(fù)序列,每單元長度在1～6bp之間根據(jù),重復(fù)單元的構(gòu)成與分布,由2～6個核苷酸組成,具有高度多態(tài)性的簡單串聯(lián)核苷酸重復(fù)序列,微衛(wèi)星DNA序列被分為3種類型:單一型,復(fù)合型和間斷型。MSI是指由于啟動MLH1、MSH2或較少MSH6甲基化導(dǎo)致的DNA錯配修復(fù)缺陷,這種缺陷可導(dǎo)致微衛(wèi)星的增多或減少。因此,MSI可導(dǎo)致腫瘤相關(guān)基

6、因的突變,可能是引發(fā)腫瘤的重要機制。若DNA復(fù)制錯誤的結(jié)果是等位基因片段的的缺失,則導(dǎo)致LOH的發(fā)生。LOH是腫瘤染色體上的一對等位基因缺失,DNA多態(tài)性基因座中的一個發(fā)生缺失,就失去雜合性。LOH是指與抑癌基因相關(guān)的雜合性微衛(wèi)星位點常伴有等位基因酌丟失。而目前分析LOH已成為檢測抑癌基因失活、發(fā)現(xiàn)和定位新的腫瘤抑制基因的重要手段之一[7]。由于LOH存在于在雜合體中,因此,如果在標(biāo)記體細(xì)胞DNA多態(tài)性顯示有雜合性,則在腫瘤細(xì)胞中就可觀

7、察到LOH[8]。
　　 Kruppel樣因子6(Kruppel-like factor6,KLF6),又稱ZF9/CPBP,是近年發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。KLF6基因位于人類染色體圖譜的10號染色體短臂(10p15),由4個外顯子組成,分別為218、574、124、525bp,突變常發(fā)生在2、3外顯子,其中外顯子2編碼KLF6蛋白的轉(zhuǎn)錄活性域。核轉(zhuǎn)錄因子KLF6是一種損傷后修復(fù)基因,對TGF—β1及其受體具有反式激活作用,該基因具

8、有典型的DNA結(jié)合域及轉(zhuǎn)錄激活域,激活后能移位入核反式作用于富含GC盒的DNA序列結(jié)合元件的啟動子,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其下游多種靶基因的表達[9]。已發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中如,前列腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌等組織中不同程度存在KLF6基因缺失或突變,并且失去了其抗細(xì)胞增殖能力,因此被認(rèn)為是一新的抑癌基因[10-12]。研究KLF6基因遺傳不穩(wěn)定性與肝癌臨床病理特性的關(guān)系,對于了解KLF6與肝癌發(fā)生的作用及其與肝癌的轉(zhuǎn)移機制,有著重要臨床意義。

9、r>　　 研究目的：
　　 了解微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和雜合性缺失(LOH)在肝癌中的作用機制,研究KLF6基因D1716、M1、M2、M4位點在肝癌中的遺傳不穩(wěn)定性,及MSI和LOH對肝癌組織蛋白表達的影響,闡明KLF6基因遺傳不穩(wěn)定性與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,為揭示KLF6作為抑癌基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制,提供理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 (1)苯酚-氯仿抽提法,提取石蠟包埋的肝癌組織基因DNA。

10、(2)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、常規(guī)銀染檢測KLF6位點的遺傳不穩(wěn)定性。(3)Envision免疫組織化學(xué)染色檢測KLF6的蛋白表達。(4)Imagepro Plus計算機圖像分析軟件分析蛋白表達。(5)SPSS軟件統(tǒng)計分析相關(guān)性。
　　 研究結(jié)果：
　　 肝癌KLF6基因微衛(wèi)星位點LOH的檢出率為35.71％(10/18),與肝癌患者年齡、分化程度、包膜的有無無相關(guān)性,但與臨床TNM分期密切相關(guān)(P<0.01

11、),LOH在肝癌Ⅲ+Ⅳ期檢出率為75.00％(6/8)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期的20.00％(4/20)。MSI檢出率為17.86％(5/28)。MSI與肝癌患者的年齡、肝癌的分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期和包膜有無均無相關(guān)性。KLF6在正常組織中不表達或者低表達；肝癌中KLF6蛋白陽性檢出率為50.00％(14/28),與患者年齡、肝癌淋巴轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期和包膜的有無均無相關(guān)性,在KLF6蛋白表達陽性的腫瘤中LOH陽性率為7.14％(

12、1/14),顯著低于LOH陰性組的64.29％(9/14)的表達率(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 KLF6基因的遺傳不穩(wěn)定性可能是肝癌發(fā)生發(fā)展的一個重要機制,MSI和LOH通過不同的途徑調(diào)控肝癌的發(fā)生和發(fā)展,KLF6基因LOH的發(fā)生率與淋巴轉(zhuǎn)移正相關(guān)。LOH在KLF6雜合性缺失的過程中起了重要作用,可作為肝癌惡化及進展的一個指標(biāo),MSI則影響到腫瘤的預(yù)后,二者對KLF6蛋白表達的影響表明KLF6不僅是個腫瘤抑制基