DcR3反義RNA對肝癌的作用及與順鉑協(xié)同效應(yīng)的觀察.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文DcR3反義RNA對肝癌的作用及與順鉑協(xié)同效應(yīng)的觀察姓名：段偉宏申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：吳泰璜20050101爾人學(xué)I尊十學(xué)何論文段與誘發(fā)細胞凋亡有關(guān)。作為生物治療重點部分的誘導(dǎo)凋亡治療將成為人類征服肝癌的有力手段。DecoyReceptor3(DcR3)是1998年P(guān)ittiRIvl首先發(fā)現(xiàn)的一種陷阱分子，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，DcR3基因定位于染色體20q133上，該基因編碼一種無明顯跨

2、膜序列的分泌型蛋白，能特異性結(jié)合FasL，阻斷由Fas／FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞凋亡。研究表明，部分人類惡性腫瘤(肺癌、胃癌、肝癌等)中存在DcR3基因過度表達及擴增，而且這種過度表達僅發(fā)生于腫瘤細胞，腫瘤周圍J下常組織則檢測不到該基因的表達。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，DcR3基因過度表達與腫瘤免疫逃逸及抵抗機體細胞凋亡機制有關(guān)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前國際上對該基因研究并不充分，但是鑒于DcR3與肝癌細胞凋亡的密切關(guān)聯(lián)及它在肝癌患者血清中特

3、異地高表達，我們認為DcR3是一個有較高研究價值的基因，明確它在幫助肝癌細胞逃避免疫監(jiān)視及免疫殺傷中的作用，阻斷其表達對肝癌細胞之凋亡有無促進成為我們研究的目標(biāo)。第一部分DcR3反義RNA構(gòu)建及表達目的：DcR3(decoyreceptor3)屬于腫瘤壞死因予受體超家族成員，能競爭性地結(jié)合LIGHT及FasL，抑制LIGHT及FasL介導(dǎo)的細胞凋亡，使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視及免疫殺傷而得以存活。本實驗利用反義RNA技術(shù)觀察在DcR3基因片

4、段與其反義DcR3基因片段結(jié)合后，凋亡有無增加與傳統(tǒng)化療藥順鉑比較，何者促凋亡效應(yīng)更強二者是否具有協(xié)同效應(yīng)為此，第一部分實驗首先構(gòu)建DcR3反義RNA，將其轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，比較其表達情況。方法：從新鮮肝癌細胞中提取總RNA，在DcR3基因序列引物限制下進行RTPCR反應(yīng)，得到大量DcR3的DNA片段，將該基因片段進行電泳鑒定并做基因測序分析，確定之后對其進行BamHI、XholI雙酶切，使DcR3片段粘性末端裸露；同時對質(zhì)粒PVAXI(一

5、)進行BamHI、XholI雙酶切；將此具有粘性末端的二者在T4DNA連接酶的作用下進行反義連接，得到PVAXIasDcR3，將其轉(zhuǎn)染肝癌細胞株SMMC7721，之后以Bactin為內(nèi)參照，用WesternBlot方法檢測單純肝癌細胞株SMMC一7721組、轉(zhuǎn)染了PVAXIasDcR3的肝癌細胞株SMMC一7721組、轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒PVAXI的肝癌細胞株SMMC7721組，比較三組蛋白表達量有無差別。結(jié)果：對DcR3基因片段進行電泳鑒定，