肝癌細(xì)胞在基底膜成分趨化作用下偽足形成的動(dòng)力學(xué)行為研究.pdf

1、本文應(yīng)用生物力學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等方法和技術(shù)，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)細(xì)胞為研究對(duì)象，繼承本院在肝膽流變學(xué)領(lǐng)域的研究特色，參照Dong等方法，研究腫瘤細(xì)胞在基底膜成分趨化作用下偽足形成的動(dòng)力學(xué)機(jī)理。本研究方法具有直觀、精細(xì)，易定量的特點(diǎn)；建立的雙微吸管趨化實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)現(xiàn)了同一細(xì)胞上偽足形成的嚴(yán)格對(duì)比研究。同時(shí)所建立的實(shí)驗(yàn)方法還為癌轉(zhuǎn)移研究和抗癌轉(zhuǎn)移藥物抗趨化特性的評(píng)價(jià)提供了可靠的單

2、細(xì)胞研究方法。 本課題的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： (1)用單微吸管法對(duì)肝癌細(xì)胞在Ⅳ型膠原(typeⅣcollagen，ColⅣ)、層粘連蛋白(laminin，LN)趨化作用下偽足生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，同時(shí)考察了肝癌細(xì)胞偽足的形成分別對(duì)趨化液中ColⅣ和LN濃度的依賴(lài)性。隨著ColⅣ趨化劑濃度的增加(100μg/ml～400μg/ml)，HCC細(xì)胞的偽足長(zhǎng)度增加；當(dāng)ColⅣ濃度≥400μg/ml時(shí)，細(xì)胞偽足的長(zhǎng)度基本不變。隨著L

3、N趨化劑濃度的增加(50μg/ml～200μg/ml)，HCC細(xì)胞的偽足長(zhǎng)度增加；當(dāng)LN濃度≥200μg/ml時(shí)，細(xì)胞偽足的長(zhǎng)度基本不變。 (2)應(yīng)用雙微管法研究濃度不對(duì)稱(chēng)趨化實(shí)驗(yàn)中雙側(cè)偽足形成的相互影響和趨化劑種類(lèi)不同時(shí)趨化性偽足形成的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：固定單側(cè)微吸管濃度，濃度高的一側(cè)細(xì)胞偽足長(zhǎng)度高于濃度低的一側(cè)；雙側(cè)偽足一側(cè)因趨化濃度下降而偽足生成減弱可使另一側(cè)偽足生成增強(qiáng)。比較趨化劑種類(lèi)不同而濃度相同時(shí)，即雙側(cè)微吸管中一

4、側(cè)充滿(mǎn)200μg/mlColⅣ，而另一側(cè)為200μg/mlLN，LN的趨化性偽足生長(zhǎng)速率比ColⅣ更快，且偽足的峰值更大。 (3)FACS對(duì)HCC細(xì)胞表面整合素表達(dá)的分析。對(duì)選定的HCC細(xì)胞株(7721)表面進(jìn)行整合素α1、α2、α3、α4、α5、α6、β1亞單位表達(dá)率的測(cè)定。結(jié)果顯示：對(duì)選定的細(xì)胞株，整合素α1、α3、β1呈強(qiáng)表達(dá)，其表達(dá)率分別為95.07％，95.55％，95.78％；α5表達(dá)率為34％[58]；而α2、α4

5、、α6呈弱表達(dá)，其表達(dá)率分別為23.17％，2.47％，14.29％。 (4)為了討論整合素阻斷對(duì)HCC細(xì)胞趨化性偽足形成的影響，將整合素抗體加入充滿(mǎn)趨化劑的單微吸管中，動(dòng)態(tài)觀察整合素阻斷對(duì)趨化性偽足形成的影響。為進(jìn)一步研究整合素阻斷對(duì)細(xì)胞兩側(cè)偽足形成的相互影響上，采用一種相互對(duì)稱(chēng)性雙微吸管法，即細(xì)胞兩側(cè)微吸管中趨化劑種類(lèi)及濃度相同，于一側(cè)微吸管內(nèi)加入單克隆抗體anti-αn(n=1-6)和anti-β1研究細(xì)胞表面整合素阻斷對(duì)

6、雙側(cè)偽足形成平衡的影響。結(jié)果表明：通過(guò)整合素阻斷實(shí)驗(yàn)，Anti-α2、Anti-α3、Anti-β1對(duì)肝癌細(xì)胞在ColⅣ趨化運(yùn)動(dòng)時(shí)偽足的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用(P＜0.01)，表明HCC細(xì)胞在體外Ⅳ膠原環(huán)境下，主要通過(guò)α2β1、α3β1受體的影響HCC細(xì)胞的趨化偽足形成；同時(shí)，Anti-α3、Anti-α6、Anti-β1對(duì)肝癌細(xì)胞在LN趨化運(yùn)動(dòng)時(shí)偽足的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用(P＜0.01)，HCC細(xì)胞在體外LN環(huán)境下，主要通過(guò)α3β1和α

7、6β1受體的影響HCC細(xì)胞的趨化性偽足形成。 (5)整合素阻斷對(duì)HCC與ColⅣ裱襯表面粘附力的影響 i.未加入抗體的控制組裱襯濃度的選擇：本研究ColⅣ濃度選為5μg/ml，其粘附力為952±134(×10-10N，n=60)。 ii.依次加入不同濃度的單克隆抗體，考察整合素阻斷對(duì)HCC細(xì)胞與ColⅣ裱襯表面粘附力的影響。結(jié)果表明：與控制組比較，HCC細(xì)胞與ColⅣ的粘附加入單抗體后，anti-α1幾乎對(duì)粘附無(wú)

8、影響；anti-α5影響較小；anti-α6對(duì)粘附的抑制作用最大，其次為anti-α4、anti-β1、anti-α3、anti-α2。說(shuō)明在肝癌細(xì)胞與Ⅳ型膠原裱襯表面粘附過(guò)程中，整合素α2、α3、α4、α6、β1對(duì)肝癌細(xì)胞的粘附過(guò)程有影響，而α5影響較小，α1幾乎對(duì)粘附無(wú)影響。 (6)BoydenChamber研究整合素阻斷對(duì)群體細(xì)胞趨化性遷移運(yùn)動(dòng)的影響 采用Boyden小室法，考察肝癌細(xì)胞整合素阻斷對(duì)細(xì)胞分別向Col

9、Ⅳ和LN趨化遷移運(yùn)動(dòng)的影響。對(duì)Ⅳ型膠原而言，與控制組比較(未經(jīng)整合素阻斷的細(xì)胞)，加入anti-α1幾乎對(duì)HCC細(xì)胞的趨化性遷移無(wú)影響，而分別加入anti-α4、anti-α5、anti-α2、anti-α3、anti-α6、anti-β1時(shí)，細(xì)胞的趨化性遷移受到的抑制作用逐漸增加；對(duì)LN而言，與控制組比較(未經(jīng)整合素阻斷的細(xì)胞)，加入anti-α4、anti-α1幾乎對(duì)HCC細(xì)胞的趨化性遷移無(wú)影響，而分別加入anti-α2對(duì)肝癌細(xì)胞的

10、遷移抑制作用最強(qiáng)，其次是anti-α5、anti-β1、anti-α6、anti-α3對(duì)細(xì)胞的遷移有著不同程度的抑制。 (7)從FACS及Boyden小室和微吸管結(jié)果實(shí)驗(yàn)研究HCC細(xì)胞趨化性遷移中相關(guān)的整合素分子與趨化性偽足形成和粘附相關(guān)的整合素分子的關(guān)系。 由微吸管實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)：肝癌細(xì)胞對(duì)Ⅳ型膠原趨化性偽足形成過(guò)程中，整合素亞單位α2、α3、β1為趨化性偽足形成的重要受體分子；從整合素阻斷研究考察HCC與ColⅣ膠原裱襯表

11、面粘附力的影響發(fā)現(xiàn)，整合素α2、α3、α4、α6、β1對(duì)肝癌細(xì)胞的粘附過(guò)程有影響，而α5影響相對(duì)較小，α1幾乎對(duì)粘附無(wú)影響。而B(niǎo)oyden小室對(duì)群體細(xì)胞趨化性遷移的研究表明：整合素α5、α2、α3、α6、β1細(xì)胞的趨化遷移的影響逐漸明顯，而α4影響較小。因此肝癌細(xì)胞趨化遷移過(guò)程中，整合素α2、α3、β1既對(duì)肝癌細(xì)胞的趨化偽足形成的受體，又是肝癌細(xì)胞的粘附受體；而整合素α6對(duì)肝癌細(xì)胞的粘附起作用；而α1對(duì)肝癌細(xì)胞與Ⅳ型膠原的趨化及粘附均影

12、響極小。將以上三種方法進(jìn)行綜合考慮發(fā)現(xiàn)，HCC細(xì)胞向Ⅳ型膠原趨化性遷移相關(guān)的整合素分子基本上為偽足形成相關(guān)的整合素受體和粘附相關(guān)的受體總和，這提示細(xì)胞趨化遷移運(yùn)動(dòng)中偽足的形成和粘附介導(dǎo)的細(xì)胞體的遷移均有整合素分子的參與。 對(duì)LN而言，整合素α3、α6、β1為趨化性偽足形成的重要受體分子；而B(niǎo)oyden小室對(duì)群體細(xì)胞的研究表明：整合素α2、α5、β1、α6、α3對(duì)細(xì)胞的趨化遷移運(yùn)動(dòng)有影響，說(shuō)明肝癌細(xì)胞遷移過(guò)程中，整合素α3、α6、