豇豆品種間抗熱性的比較及AtHSF1a基因轉(zhuǎn)化黃瓜與煙草研究.pdf

1、植物與環(huán)境的關(guān)系一直是植物學(xué)研究的重點(diǎn)問(wèn)題，包括植物如何對(duì)高溫、干旱等外環(huán)境的脅迫做出一系列反應(yīng)及這些反應(yīng)之間有著怎樣的聯(lián)系。研究表明逆境脅迫可以引起植物體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)：細(xì)胞膜透性增大，胞質(zhì)外滲量增加；膜脂過(guò)氧化程度加劇，MDA積累；活性氧含量增加。植物體內(nèi)啟動(dòng)抗氧化酶和非酶抗氧化物質(zhì)發(fā)生應(yīng)答性反應(yīng)，以阻止、降低或修復(fù)由高溫造成的損傷。本論文選用之豇28_2、紅豇豆、寧豇三號(hào)、龍翔一號(hào)、攀豇一號(hào)、白籽豇豆、紫秋豇和高產(chǎn)四號(hào)等8

2、個(gè)具有不同耐熱性的豇豆品種為試驗(yàn)材料，利用人工氣候室在苗期進(jìn)行高溫脅迫處理，測(cè)定了豇豆葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、主要抗氧化酶類的活性等相關(guān)生理指標(biāo)，并通過(guò)雙向電泳技術(shù)，分析了豇豆葉片蛋白在高溫脅迫過(guò)程中的表達(dá)情況；同時(shí)，本論文還克隆了擬南芥熱激因子基因AtHSF1a，并導(dǎo)入煙草和黃瓜基因組，并對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了抗熱性分析，以期為發(fā)掘重要植物抗熱基因和改良作物的抗熱性等方面研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.8個(gè)豇豆品種在高溫脅

3、迫下細(xì)胞膜透性增大、丙二醛在體內(nèi)積累，但之豇28-2的熱害指數(shù)相對(duì)較小，相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量增加相對(duì)較少，表明高溫脅迫下之豇28-2質(zhì)膜損傷程度較輕，耐熱性較強(qiáng)。 2.高溫脅迫過(guò)程中，豇豆的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶都表現(xiàn)為先上升后下降，而之豇28-2的SOD、POD、CAT活性始終處于較高水平，表明之豇28-2具有的較高保護(hù)酶活性，能更好的抵御熱傷害。 3.采用雙向電泳技術(shù)對(duì)熱激誘導(dǎo)的之豇28-2葉片蛋白

4、質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行了分析，經(jīng)PDQuest8.0分析軟件處理考染雙向電泳圖譜，顯示出約500個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。以未熱激對(duì)照材料的蛋白質(zhì)2-DE圖譜為參照膠，發(fā)現(xiàn)45℃高溫處理5小時(shí)后產(chǎn)生105個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中，高溫脅迫時(shí)特異性誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為25個(gè)，抑制表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為23個(gè)，上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為34個(gè)(表達(dá)量相差2倍以上)，下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為24個(gè)(表達(dá)量相差2倍以上)。 4.根據(jù)已知的擬南芥熱激因子AtHSF1a基因

5、序列設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性引物，用PrimStar HS DNA聚合酶從擬南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia生態(tài)型植株基因組DNA中擴(kuò)增出目標(biāo)片段。純化后的目標(biāo)片段經(jīng)Taq DNA聚合酶加“A”尾巴后，采用TA Cloning的方法克隆到pMD18-T載體中，得到重組質(zhì)粒pMD-AtHSF1a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，挑取白色的重組子單菌落進(jìn)行PCR篩選和質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證。委托上海生工生物有限公司對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序

6、，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段為1676 bp，與已發(fā)表的序列(Genbank登錄號(hào)NM_117884)一致。 5.質(zhì)粒pMD-AtHSF1a和pV-HSP70bGUS分別經(jīng)Xba I/Sac I雙酶切后回收含有AtHSF1a的小片段和去GUS的大片段，將兩片段連接得到植物表達(dá)載體pV-70bAtHSF1a。 6.以無(wú)菌煙草葉片為材料，用農(nóng)桿菌EHA105/pV-70bAtHSF1a作菌株，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)和抑菌培養(yǎng)后，在M

7、S+2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+150 mg/L Kan.+300 mg/L Cb+3％蔗糖+0.7％瓊脂(pH5.8)抗性篩選培養(yǎng)基上得到煙草的抗性愈傷組織和抗性芽。將抗性芽轉(zhuǎn)到抗性生根培養(yǎng)基中，得到具有Kan.抗性的煙草轉(zhuǎn)基因植株。移栽后，用CTAB法提取其基因組DNA。PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AtHSF1a基因的植株基因組DNA能擴(kuò)增出1676 bp的目標(biāo)片段，與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照一致。表明目的基因AtHSF

8、1a已經(jīng)整合到煙草基因組中。通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量和SOD酶活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草5號(hào)的耐熱性顯著高于野生型對(duì)照。 7.將在黃瓜分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2天的黃瓜子葉投入到活化的農(nóng)桿菌EHA105/pV-70bAtHSF1a菌液中侵染8～10分鐘。經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)，抑菌培養(yǎng)和80 mg/L的Kan.抗性篩選后得到黃瓜的抗性愈傷組織。每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基直至分化出抗性不定芽，取不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，獲得1株具有Ka