八棱海棠(Malus robusta)兩個(gè)多酚氧化酶基因的克隆及降解酚類(lèi)化合物的初步功能鑒定.pdf

1、酚類(lèi)污染對(duì)人類(lèi)的生存環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，污水中的酚類(lèi)化合物能夠毒死水生生物，危害作物，污染水源，并嚴(yán)重?fù)p害人類(lèi)的身體健康。這類(lèi)污染物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源廣泛，難以降解，是工業(yè)、農(nóng)藥、材料生產(chǎn)中產(chǎn)生的一類(lèi)主要高毒污染物。利用植物降解的方法處理酚類(lèi)化合物是一種創(chuàng)新、經(jīng)濟(jì)且無(wú)二次污染的方法。目前，有關(guān)植物修復(fù)有機(jī)污染物的研究和報(bào)道較少，并且使用果樹(shù)的多酚氧化酶用于有機(jī)污染物修復(fù)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。從植物中克隆出能夠降解特定污染物的高效基因，有針對(duì)

2、性的轉(zhuǎn)到另外一種植物中并發(fā)揮這個(gè)基因的降解功能，在有毒有害污染物植物治理中顯示出巨大的潛力。在本研究中，利用RT-PCR(reverse transcriptionPCR)技術(shù)從八棱海棠cDNA文庫(kù)中克隆到兩個(gè)基因，命名為MdPPO2B、MdPPO3B，cDNA全長(zhǎng)序列1773bp、1788bp。以八棱海棠基因MdPPO2B、MdPPO3B為研究對(duì)象，運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)、在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和有機(jī)污染物的抗性分析，

3、所獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、生物信息學(xué)研究結(jié)果表明:通過(guò)在GeneBank上進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MdPPO2B、MdPPO3B基因分別在169～374、165-374氨基酸區(qū)域與酪氨酸酶超級(jí)家族核心序列高度同源，含有高度保守的2個(gè)亞結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)銅離子。構(gòu)建的同源進(jìn)化樹(shù)表明，MdPPO2B、MdPPO3B在進(jìn)化關(guān)系上與蘋(píng)果、梨、枇杷等最近，繡線梅、甜梅次之。同源建模SWISS-MODEL的結(jié)果表明，這兩個(gè)基因的蛋白都含

4、有三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。此外，在C端有一個(gè)高度保守的序列，這個(gè)家族的許多成員來(lái)自植物的多酚氧化酶。
　　2、八棱海棠兩個(gè)多酚氧化酶基因MdPPO2B、MdPPO3B在巴斯德畢赤酵母中得到了有效的表達(dá)。通過(guò)分光光度法，以鄰苯二酚作為底物，確定了八棱海棠兩個(gè)PPO最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH、金屬離子和抑制劑對(duì)酶活影響等酶學(xué)性質(zhì)。兩個(gè)PPO分別在pH6.5、pH7.0和40℃下，表現(xiàn)出最大酶活力。在4mM下，Cu2+、Mg2+、Fe2+表

5、現(xiàn)出對(duì)酶活力的促進(jìn)作用，而Zn2+、Ca2+、Fe3+抑制酶活力。1mM的EDTA、檸檬酸、L-半胱氨酸對(duì)PPO活性的抑制率達(dá)50％以上。以鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸作為底物時(shí)，MdPPO2B和MdPPO3B Km,值分別為0.167 mM、7.92 mM;0.167 mM、8.68 mM。
　　3、為了進(jìn)一步分析MdPPO2B和MdPPO3B基因的功能，通過(guò)構(gòu)建農(nóng)桿菌-植物雙元表達(dá)載體，以改造模式植物擬南芥，研究利用植物降解污染物方