降解纖維蛋白原可減少創(chuàng)傷性腦損傷后瘢痕的形成.pdf

1、前言
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)損傷包括腦卒中、腦創(chuàng)傷、心臟驟停和窒息造成的腦缺血缺氧，麻醉和手術(shù)意外造成的神經(jīng)損傷，也包括最常見的脊髓損傷。損傷后可出現(xiàn)休克，癱瘓，感覺障礙，大小便失禁，語言障礙等，嚴(yán)重的可以引起死亡，給社會及家庭帶來了極大地的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　近來研究表明，創(chuàng)傷性腦損傷損傷后在損傷部位由于腦膜成纖維細(xì)胞的遷移，這些細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)分子(extracellul

2、armatrixmolecules，ECMs)，如膠原、纖粘連蛋白等形成纖維瘢痕，這些瘢痕組織被認(rèn)為是促進(jìn)了傷口愈合，但對神經(jīng)突的再生卻起到了阻礙作用。在創(chuàng)傷性腦損傷過程中，由于出血等因素可導(dǎo)致血液中的纖維蛋白原的漏出，纖維蛋白原被活化以后可以促進(jìn)TGF-β(transforminggrowthfactor-β)信號通路的激活。有文獻(xiàn)報道TGF-β信號通路被激活后促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)擬通過腹腔注射巴曲酶來降解

3、纖維蛋白原，從而抑制TGF-β信號通路的活化的方法來減少兩種瘢痕組織在損傷部位的形成，提高神經(jīng)纖維再生的可能性。
　　材料與方法
　　一、成年小鼠腦損傷模型的制備
　　用于本實(shí)驗(yàn)的8周齡KM小鼠購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部。按照川野的方法(2005年JNeurosciRes)制備小鼠黑質(zhì)紋狀體通路損傷模型。小鼠經(jīng)10％水合氯醛（0.03ml/g體重）腹腔注射麻醉后固定在腦立體定位儀（成都泰盟）上。門齒欄設(shè)置在耳屏線下3m

4、m。剪毛消毒后在頭皮中央切口，清除頂骨骨膜，在前囟點(diǎn)右后方1.5mm處用牙鉆開出一長方形缺口，暴露大腦。寬度2.0mm的切刀固定在直線型立體框架內(nèi)，于右側(cè)顱骨中線外側(cè)0.5mm，前囟點(diǎn)后1.5mm，距離大腦表面深度為6.0mm插入切刀。然后緩慢拔出刀片，止血縫合。
　　二、分組
　　分為對照組與實(shí)驗(yàn)組。每組30只，各組再分為1d(n=3)、4d(n=9)、7d(n=9)、14d(n=9)。實(shí)驗(yàn)組在腦損傷模型制備后的1h、24

5、h、48h按小鼠體重分3次腹腔注入巴曲酶注射液(劑量:30BU/kg，TOBISHI)。對照組損傷模型制備后不做任何藥物的注射。
　　三、取材及切片
　　小鼠損傷模型制備后在4、7、14天取腦。簡述之，小鼠在10％水合氯醛麻醉下，行心臟灌流固定，4％多聚甲醛中后固定過夜，并轉(zhuǎn)移至30％的蔗糖中前處理，待腦組織沉淀后用冷凍切片機(jī)制成40μm厚水平斷面浮游切片，切片保存在冷凍保護(hù)劑的溶液里，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　四、免疫

6、組織化學(xué)方法
　　根據(jù)SABC方法操作測定COL(IV)、GFAP、FN在損傷部位的表達(dá)，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片后晾干，室溫保存。光鏡下觀察免疫陽性產(chǎn)物的位置、分布、染色的強(qiáng)弱及陽性細(xì)胞的數(shù)量，并通過陽性產(chǎn)物的光密度值分析，檢測各指標(biāo)的表達(dá)強(qiáng)度。
　　五、免疫熒光雙重顏色方法
　　通過GFAP與FN的免疫熒光雙重染色的方法，在共聚焦鏡下觀察瘢痕的位置關(guān)系以及表達(dá)情況。
　　六、Westernblo

7、tting
　　小鼠損傷模型制備后在1、4、7、14天取腦，以損傷側(cè)小鼠大腦半球的損傷部位為中心，取前后2mm腦組織，剪碎裂解，4℃離心(12000r·min-1，30min)，取上清。進(jìn)行BCA法蛋白定量后，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加一抗TGF-βRⅡ(1∶500)，二抗為羊抗兔lgG，ECLplus化學(xué)發(fā)光法顯色，image-J圖像分析系統(tǒng)分析。內(nèi)參選用GAPDH抗體。目的蛋白與相應(yīng)GAPDH蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量

8、。
　　七、統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有試驗(yàn)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。各組ColⅣ和GFAP的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)來分析，各組TGF-βRⅡ的比較采用單因素方差分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、免疫組織化學(xué)及免疫熒光雙重染色
　　在小鼠黑質(zhì)紋狀體損傷模型4天后，對照組在損傷中心區(qū)可見ColⅣ密度區(qū)，7天后更明顯，14天仍然密集沉積

9、于損傷中心;而實(shí)驗(yàn)組在4天后，損傷部位有空洞形成，周邊有少量ColⅣ沉積，7天后損傷部位幾乎愈合，僅有少許ColⅣ沉積，14天后瘢痕幾乎消失。同樣在損傷后4天，對照組損傷周圍有大量GFAP陽性的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞突起變長，形成類似境界膜樣的結(jié)構(gòu);損傷后7天，星形膠質(zhì)細(xì)胞同樣存在于損傷周邊，但突起變短，14天后星形膠質(zhì)細(xì)胞基本恢復(fù)正常形態(tài)。在實(shí)驗(yàn)組可以發(fā)現(xiàn)在損傷部位周圍有同樣的反應(yīng)，但損傷4天后的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起較對照組短，未見到境

10、界膜的形成;7天后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞與對照組相比較少;而14天后與對照組陽性反應(yīng)無差異。在免疫熒光染色中觀察到GFAP陽性反應(yīng)圍繞在FN陽性反應(yīng)周圍，實(shí)驗(yàn)組中可以看到星形膠質(zhì)細(xì)胞突破界膜進(jìn)入到損傷中心，而且損傷也逐漸變小。
　　二、Westernblotting
　　Westernblottiing中，對照組與實(shí)驗(yàn)組TGF-βRⅡ蛋白的光密度與內(nèi)參GAPDH光密度的比值在損傷后1天分別為0.8119±0.0456與0.563

11、8±0.0327;損傷后4天分別為0.9536±0.0512與0.6563±0.0446;損傷后7天分別為0.7154±0.0672與0.5359±0.0444;損傷14天后分別為0.6128±0.0478與0.396±0.028?？梢园l(fā)現(xiàn)與對照組相比實(shí)驗(yàn)組組TGF-βRⅡ蛋白表達(dá)有所減少。
　　結(jié)論
　　1.創(chuàng)傷性腦損傷后，在損傷周邊易形成以反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖為特征的膠質(zhì)瘢痕以及在損傷中心易形成以成纖維細(xì)胞聚集為特征的