結(jié)直腸癌患者外周血CK20 mRNA表達(dá)的相關(guān)因素分析及其對預(yù)后的預(yù)測價(jià)值.pdf

1、研究背景: 結(jié)直腸癌在世界范圍內(nèi)都是最常見的惡性腫瘤之一。在歐洲，結(jié)直腸癌無論是從發(fā)病率還是死亡率而言都是第二常見的惡性腫瘤。在亞洲包括我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病數(shù)近幾十年上升了2～4倍。雖然結(jié)直腸癌的治療方法不斷改進(jìn)，但患者的生存率仍無明顯改善。遠(yuǎn)處器官(肝、肺等)的血行轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后最常見和最嚴(yán)重的問題之一。因此，早期檢測血行轉(zhuǎn)移并推斷患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性對于結(jié)直腸癌的治療是至關(guān)重要的。血循環(huán)中游離腫瘤細(xì)胞(circulating

2、 tumor cells，CTCs)的存在是腫瘤發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步尤其是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)使血液中少許腫瘤細(xì)胞的檢出成為可能。細(xì)胞角蛋白20(cytokeratin，CK20)的表達(dá)具有嚴(yán)格的上皮組織特異性，在非上皮來源的正常血液中不表達(dá)。因此，一旦在結(jié)直腸癌患者外周血中檢出有CK20 mRNA

3、的陽性表達(dá)，即可推斷有惡性腫瘤細(xì)胞的異位存在。然而，結(jié)直腸癌患者無論是在術(shù)前還是術(shù)中外周血CK20 mRNA表達(dá)的生物學(xué)意義仍不清楚，其表達(dá)的相關(guān)因素及其與患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確。Ki-67是一種人類核增殖抗原，可以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，對于判斷腫瘤預(yù)后有一定的價(jià)值。 研究目的: 探討結(jié)直腸癌患者圍手術(shù)期外周血CK20 mRNA表達(dá)與臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)了解外周血CK20 mRNA與相應(yīng)腫瘤組織CK20及Ki-

4、67表達(dá)之間的關(guān)系，評價(jià)外周血CK20 mRNA表達(dá)的臨床意義，初步探討其是否可以作為結(jié)直腸癌血行轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)。研究方法:建立CK20 mRNA巢式RT-PCR法，應(yīng)用健康人外周血和結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞系評價(jià)其檢測敏感性。 選擇57例于2000年4月至2001年3月間在我院手術(shù)的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，分別于手術(shù)前和術(shù)中切除腫瘤以后各抽取10 ml外周血，并收集腫瘤標(biāo)本，詳細(xì)登記患者的臨床病理資料，術(shù)后對患者進(jìn)行長

5、期隨訪直至患者死亡或手術(shù)后5年底為止。 應(yīng)用巢式RT-PCR法分別檢測實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)前和術(shù)中外周血CK20 mRNA的表達(dá)，并應(yīng)用免疫組化EnVision<'TM>法檢測相應(yīng)腫瘤組織CK20和Ki-67的表達(dá)。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床病理資料以及長期隨訪結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 本研究還選擇同一時(shí)期收入我院的15例結(jié)直腸良性病變患者以及10例健康獻(xiàn)血者設(shè)為對照組，各抽取10 ml外周血，檢測CK20 mRNA的表達(dá)。 研究結(jié)果

6、: 每1 ml健康人外周血中混入5個(gè)以上HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞，CK20 mRNA巢式RT-PCR法就可以檢測到它的存在。 實(shí)驗(yàn)組57例散發(fā)性結(jié)直腸癌患者中，男性35例，女性22例，平均年齡(61.o±14.3)歲；結(jié)腸癌24例(其中近段結(jié)腸癌11例，遠(yuǎn)段結(jié)腸癌13例)，直腸癌33例。 實(shí)驗(yàn)組圍手術(shù)期外周血CK20 mRNA的總檢出率(術(shù)前和/或術(shù)中檢測陽性的例數(shù)/總例數(shù))為59.6％(34/57)。術(shù)前陽性

7、率為42.1％(24/57)，術(shù)中增至56.1％(32/57)，差異有顯著性(McNemar檢驗(yàn)，P=0.039)。而結(jié)直腸良性病變對照組和健康對照組中均無一例外周血中檢測到CK20 mRNA。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者圍手術(shù)期外周血CK20 mRNA的陽性率依次為33.3％(2/6)、47.4％(9/19)、63.6％(14/22)、90.0％(9/10)，呈逐漸升高的趨勢(線性趨勢檢驗(yàn)，P=0.010)。而且，與未發(fā)生轉(zhuǎn)移(Ⅰ、

8、Ⅱ期)的患者相比，已發(fā)生淋巴結(jié)或血行轉(zhuǎn)移(Ⅲ、Ⅳ期)患者的外周血CK20 mRNA的陽性率顯著增高(x<'2>檢驗(yàn)，P=0.033)。而不同腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型和分化程度的結(jié)直腸癌患者外周血CK20 mRNA的表達(dá)均無顯著性差異(P值分別為0.411、0.620、0.449、0.388)。外周血CK20 mRNA的表達(dá)與CEA、CA50、CAl9-9、CA242等血清腫瘤標(biāo)志物水平亦無顯著性相關(guān)(P值均>0.05)。本組結(jié)直腸

9、癌腫瘤組織中CK20和Ki-67的陽性表達(dá)率分別為86.0％(49/57)和80.7％(46/57)。結(jié)直腸癌腫瘤組織CK20的陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，少數(shù)細(xì)胞核亦著色；Ki-67的陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞核。腫瘤組織中CK20和Ki-67的表達(dá)越強(qiáng)，相應(yīng)患者外周血CK20 mRNA的陽性率越高(P=0.042，P=0.001)。 實(shí)驗(yàn)組的隨訪率為96.5％(55/57)，其中適合生存分析者53例。外周血CK20mRNA

10、陽性和陰性患者的5年生存率分別為43.8％(14/32)、90.5％(19/21)，二者有非常顯著性差異(P=0.001)。外周血CK20 mRNA的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后顯著相關(guān)(Kaplan-Meier生存曲線，Log-rank單因素檢驗(yàn))。外周血CK20mRNA陽性患者的總生存時(shí)間(overall survival，OS)和無進(jìn)展生存時(shí)間(progression-free survival，PFS)均顯著短于陰性患者(P值分別為0

11、.00l和0.009)。并且，臨床分期(TNM分期)也與結(jié)直腸癌患者預(yù)后顯著相關(guān)。分期越晚，患者的OS和PFS越短(P<0.001，P=0.020)。而且，Ⅲ期及以上分期患者的OS和PFS均顯著短于Ⅱ期及以下分期患者(P<0.001，P=0.007)。不同TNM分期和外周血CK20 mRNA表達(dá)情況沒有對患者預(yù)后產(chǎn)生顯著的交互作用(多因素方差分析，P=0.090)。結(jié)直腸癌腫瘤組織Ki-67的表達(dá)越強(qiáng)患者的OS越短(P=0.010)，但

12、腫瘤組織Ki-67的表達(dá)與患者的。PFS卻無明顯相關(guān)(P=0.598)。COX回歸模型分析表明，TNM分期是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.018)，而外周血CK20mRNA和腫瘤組織Ki-67的表達(dá)未進(jìn)入最終模型(P值分別為0.284、0.425)。 結(jié)論: 1.CK20 mRNA巢式RT-PCR法檢測結(jié)直腸癌患者外周血中游離腫瘤細(xì)胞(CTCs)具有較高的敏感性和特異性。 2.結(jié)直腸癌患者術(shù)中外周血CK

13、20 mRNA的檢出率明顯高于術(shù)前，提示手術(shù)操作本身可能增加腫瘤細(xì)胞播散入血的機(jī)會(huì)。 3.結(jié)直腸癌患者外周血CK20 mRNA表達(dá)與TNM分期呈正相關(guān)，分期越晚外周血CK20 mRNA的陽性率越高。 4.結(jié)直腸癌腫瘤組織CK20和Ki-67的表達(dá)越強(qiáng)，相應(yīng)患者外周血CK20mRNA的陽性率越高，提示外周血CK20 mRNA的表達(dá)與原發(fā)腫瘤細(xì)胞的分化和增殖狀態(tài)密切相關(guān)。 5.外周血CK20 mRNA陽性表達(dá)的結(jié)直腸