四株不同來源海洋微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究.pdf

1、微生物多糖由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)和豐富的生物功能，培養(yǎng)條件可控等優(yōu)勢得到廣泛的應(yīng)用和規(guī)?；a(chǎn)。海洋蘊(yùn)含豐富的微生物資源，其種類多樣，性質(zhì)特異。從海洋微生物中尋找結(jié)構(gòu)新穎，活性獨(dú)特的胞外多糖具有重要理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文以14種不同海洋來源微生物的發(fā)酵液為研究對(duì)象，從中提取胞外多糖，對(duì)其進(jìn)行組成分析，從中篩選出4株海洋微生物，包括南海紅樹林內(nèi)生真菌(Aspergillus sp.Y16)，南海珊瑚共附生真菌(Aspergillus

2、 versicolor LCJ-5-4)，太平洋深海底質(zhì)來源真菌(Penicillium griseofulvum)以及南海海綿內(nèi)生真菌(Allternaria sp。SP32)，對(duì)其胞外多糖進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)研究和抗氧化活性評(píng)價(jià)。研究結(jié)果如下：
　　 1.從南海紅樹林植物厚藤內(nèi)生真菌Aspergillus sp.Y16發(fā)酵液中提取得到胞外多糖，通過Q Sepharose Fast Flow離子交換柱層析及Sephadex G1

3、50，Superdex75凝膠滲透柱層析對(duì)其分離純化，得到兩個(gè)多糖組分As1-1和As2-1，分子量分別為15 kDa和6 kDa，As1-1是由Man和Gal組成，比例為9:1；As2-1全部由Man組成。經(jīng)甲基化及1D，2D NMR分析表明，As1-1是以(1→2)-α-D-Manp為主鏈的半乳甘露聚糖，其O-6約每3個(gè)糖基存在一個(gè)分支，支鏈由β-Manp、β-Galf和少量(1→6)-α-D-Manp組成。As2-1是近似直鏈的(

4、1→6)-α-D-Manp連接的甘露聚糖，在O-3位存在一定的分支，分支由α-D-Manp及(1→3)-α-D-Manp組成。通過體外DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力及抗脂質(zhì)過氧化作用評(píng)價(jià)表明，As1-1和As2-1具有良好的體外DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，特別是As1-1，其清除DPPH自由基的EC50值為1.45 mg/mL。該研究首次從厚藤內(nèi)生真菌Aspergillus sp.Y16胞外多糖中獲

5、得了結(jié)構(gòu)新穎的以(1→2)-α-D-Manp為主鏈的具有抗氧化活性的半乳甘露聚糖，其具有潛在開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
　　 2.從南海珊瑚共附生真菌Aspergillus versicolor LCJ-5-4發(fā)酵液中提取胞外多糖，通過O Sepharose Fast Flow離子交換柱層析及Sephacryal S400，Superdex75凝膠滲透柱層析對(duì)其分離純化，得到兩個(gè)多糖組分AV-1和AVP。經(jīng)GC、HPLC、HPGPC、IR、

6、甲基化及1D，2D NMR分析表明，AV-1是以葡萄糖為主的中性雜多糖，分子量為500kDa，其結(jié)構(gòu)以(1→6)-α-D-Glcp為主要連接方式，平均9個(gè)糖基存在一個(gè)以單個(gè)非還原末端α-D-Manp形式的分支連接在主鏈(1→6)-α-D-Glcp的O-3位上。AVP是分子量為7 kDa，結(jié)構(gòu)新穎的甘露葡聚糖，其主鏈以(1→6)-α-D-Glcp為主，還含有(1→2)-α-D-Manp，也存在一定的分支，平均每8個(gè)糖基存在一個(gè)分支，而且支

7、鏈比AV-1的支鏈要長，除了非還原末端α-D-Manp以外，還含有(1→2)-α-D-Manp，連在主鏈(1→2)-α-D-Manp的O-6位上。通過體外抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)表明，AVP具有良好的清除自由基的能力，對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除EC50值分別為2.0mg/mL和1.5 mg/mL。本研究從珊瑚共附生真菌A.versicolor LCJ-5-4得到兩種胞外多糖，AV-1為具有Man分支的類似右旋糖酐結(jié)構(gòu)，AVP是結(jié)構(gòu)新

8、穎具有抗氧化活性的甘露葡聚糖，表明海洋共附生真菌是結(jié)構(gòu)新穎的活性胞外多糖的重要來源。
　　 3.從太平洋深海底質(zhì)來源的真菌灰黃青霉Penicillium griseofulvum發(fā)酵液中獲得的胞外多糖，通過Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析及Superdex75凝膠滲透柱層析分離純化得到多糖組分Ps1-1。HPGPC及HPLC研究表明，Ps1-1是分子量為20 kDa，Gal與Man的比例約為1:1的半乳

9、甘露聚糖。通過部分酸水解、甲基化、1D，2D。NMR、乙酰解和ESI MS分析表明，Ps1-1是以(1→6)-α-Manp為主鏈的磷酸化半乳甘露聚糖。其存在Man核心，核心結(jié)構(gòu)是以(1→6)-α-Manp為主鏈的多分支結(jié)構(gòu)，分支發(fā)生在主鏈的O-2位上，由單個(gè)非還原末端的α-Manp及(1→2)-α-Manp連接的二糖和三糖組成。由Gal組成的支鏈結(jié)構(gòu)連接于Man的核心結(jié)構(gòu)上，Gal支鏈由β-(1→5)-Galf組成，存在15％的分支，分

10、支由單個(gè)非還原末端的β-Galf連接在主鏈β-(1→5)-Galf的O-6上，并且存在10％左右的磷酸基取代，取代同樣在β-(1→5)-Galf的O-6位上。采用部分酸水解的方法制備寡糖，并結(jié)合Bio GelP4凝膠柱層析分離純化，得到了4個(gè)由β-(1→5)-Galf組成的聚合度為2-5的半乳寡糖，以及聚合度為3-5的磷酸化半乳寡糖。并對(duì)β-(1→5)-Galf寡糖的二級(jí)質(zhì)譜碎裂模式進(jìn)行了探討和驗(yàn)證，為通過質(zhì)譜微量分析呋喃型半乳寡糖的結(jié)

11、構(gòu)提供了依據(jù)。本研究從深海底質(zhì)來源的真菌P.griseofulvum得到了一種含有特異β-(1→5)-Galf直鏈的半乳甘露聚糖，并獲得了不同聚合度的呋喃半乳寡糖及磷酸化呋喃半乳寡糖，為我國“海洋糖庫”的建設(shè)提供了新型特征寡糖。
　　 4.從一株南海海綿內(nèi)生真菌(Alternaria sp.SP32)中提取其胞外多糖，通過QSepharose Fast Flow離子交換柱層析及Superdex75凝膠滲透柱層析分離純化得到多糖組

12、分SP-S。HPGPC和GC分析表明，SP-S的分子量為27 kDa，主要由Man、Glc和Gal組成，其比例約為3:2:1。通過連續(xù)酸水解、甲基化、1D，2D NMR及部分酸水解后寡糖的GC-MS和ESI-CID MS/MS分析表明，SP-S是以甘露糖為核心的半乳葡萄甘露聚糖。核心甘露糖主鏈由(1→6)-α-Manp組成，其O-2上存在大量由(1→2)-α-Manp組成的分支。其半乳糖以→2)-β-Galf-(1→，→2，6)-β-G

13、alf-(1→及β-Galf-(1→的連接方式，與(1→2)-α-Glcp和(1→6)-α-Glcp構(gòu)成了胞外多糖SP-S的分支結(jié)構(gòu)。經(jīng)過體外抗氧化活性研究表明，SP-S存在一定的清除自由基的活性，對(duì)DPPH自由基的清除EC50值約為5 mg/mL。這是首次從Alternaria屬真菌所產(chǎn)胞外多糖中獲得結(jié)構(gòu)新穎的半乳葡萄甘露聚糖，為研究半乳葡萄甘露聚糖的生物活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 本論文的研究成果為我國“海洋糖庫”的建設(shè)提供