PP2A-PLD1在多發(fā)傷膿毒癥分子機(jī)制中作用的研究.pdf

1、背景:
　　膿毒癥(sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome， SIRS)，臨床上證實(shí)有細(xì)菌存在或有高度可疑感染灶。革蘭陰性菌感染后數(shù)小時(shí)即可發(fā)生膿毒癥性休克，主要表現(xiàn)為血壓急劇下降、發(fā)熱、腹瀉與彌散性凝血等癥狀。在臨床上，膿毒癥導(dǎo)致的膿毒癥性休克是重癥監(jiān)護(hù)患者最常見(jiàn)的死亡原因，死亡率可達(dá)20％～80％。多發(fā)傷患者一旦出現(xiàn)膿毒癥、多器官功能障礙等

2、并發(fā)癥，往往預(yù)后較差。創(chuàng)傷（多發(fā)傷）并發(fā)的膿毒癥是眾多學(xué)者及實(shí)驗(yàn)室近年研究的熱門(mén)課題之一，雖然國(guó)際上早就提出膿毒癥診斷的PIRO分級(jí)系統(tǒng)概念，但患者發(fā)生膿毒癥的病因、背景（如年齡、基礎(chǔ)疾病或基礎(chǔ)狀態(tài)）等的不同，影響因素多樣復(fù)雜，使得膿毒癥分子機(jī)制仍未能完全闡明。目前，膿毒癥機(jī)制研究涉及到復(fù)雜的全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對(duì)不同感染病原微生物及其毒素的異常反應(yīng)等多個(gè)方面，與機(jī)體多系統(tǒng)、多器官病

3、理生理改變密切相關(guān)。
　　蛋白質(zhì)磷酸酶-2A(protein phosphatae2A，PP2A)是真核生物體內(nèi)的主要絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在結(jié)構(gòu)上擁有很多不同基因編碼的亞基，并且分別組成多種不同的PP2A全酶，參與到細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等多種細(xì)胞生物學(xué)事件，目前在酵母，果蠅和小鼠等生物學(xué)模型的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PP2A在細(xì)胞周期調(diào)控，形態(tài)以及發(fā)育中的作用，同時(shí)它又在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中與其他磷酸化酶

4、和激酶相互作用，構(gòu)成調(diào)節(jié)大分子調(diào)控下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，也可以通過(guò)可逆性磷酸化使已磷酸化激活的蛋白質(zhì)脫磷酸，在信號(hào)傳導(dǎo)中承擔(dān)負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。國(guó)外已有學(xué)者認(rèn)為PP2A是關(guān)鍵性的炎癥細(xì)胞信號(hào)內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，并且在膿毒癥引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用，是有實(shí)用價(jià)值的治療膿毒癥的藥理作用靶點(diǎn)。
　　磷脂酶D(phospholipase D，PLD)分1-2型普遍存在于細(xì)菌、真菌以及哺乳動(dòng)物中。在病原微生物中，PLD作為毒力決定

5、因子在減數(shù)分裂、孢子形成等過(guò)程中起作用;在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PLD主要在胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)有絲分裂和細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架等一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。在病原菌感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，病原體和宿主細(xì)胞的PLD都被激活并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，病原菌PLD可調(diào)節(jié)自身肌動(dòng)蛋白絲的聚合和重排，并引起宿主細(xì)胞局部肌動(dòng)蛋白絲的集聚，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞對(duì)其吞噬。深入探討PLD激活對(duì)感染發(fā)生的調(diào)控作用對(duì)透徹理解病原菌感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制具有重要意義。國(guó)外對(duì)PLD1在膿毒癥分子機(jī)制中的

6、作用的研究已展開(kāi)。
　　C-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal Kinase，JNK)信號(hào)通路是絲裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)中重要的通路之一，它位于胞質(zhì)，包含雙磷酸化功能區(qū)（由三種氨基酸Thr、Pro和Tyr組成）與c-junN端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化，JNK的活化是通過(guò)其氨基末端殘基磷酸化實(shí)現(xiàn)的，一旦被激活，胞漿中的JNK

7、移位到細(xì)胞核中。JNK信號(hào)通路在細(xì)胞周期、生產(chǎn)、凋亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過(guò)程中起重要作用。物理、化學(xué)因素引起的細(xì)胞外環(huán)境變化及致炎細(xì)胞因子調(diào)節(jié)此通路。在嚴(yán)重感染，特別是在膿毒癥期，相關(guān)資料顯示JNK信號(hào)通路受到抑制，使機(jī)體清除有害物質(zhì)能力下降，損害加重。
　　從目前資料來(lái)看，國(guó)外學(xué)者傾向認(rèn)為PP2A、PLD1在膿毒癥分子機(jī)制中可能抑制JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)而導(dǎo)致宿主感染過(guò)程加重。但上述研究均在人為控制

8、條件的細(xì)胞株及動(dòng)物模型上完成，至今無(wú)人在膿毒癥實(shí)例中驗(yàn)證相關(guān)理論，故上述研究結(jié)論的可靠性及意義受到一定影響。此外，PP2A、PLD1在膿毒癥分子機(jī)制中關(guān)聯(lián)性研究仍未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的:
　　本研究旨在通過(guò)對(duì)合并膿毒癥的多發(fā)傷患者血液中粒細(xì)胞PP2A、PLD1表達(dá)、活性及定量變化分析，同時(shí)驗(yàn)證PP2A/PLD1與JNK信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步完善膿毒癥分子機(jī)制提供一種新的途徑和補(bǔ)充。
　　方法:
　　1.檢測(cè)24

9、例膿毒癥多發(fā)傷患者、22例非膿毒癥多發(fā)傷患者發(fā)病第1d、7d及15例正常人血液中PP2A與c-jun/JNKmRNA水平及蛋白表達(dá)情況。并結(jié)合每位患者的重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive care unit，ICU)住院天數(shù)(Length of stay, LOS)、序貫臟器衰竭評(píng)分系統(tǒng)（Sequential Organ Failure Assessment, SOFA）和多器官功能衰竭（Multiple Organ Dysfunction

10、，MOD）分?jǐn)?shù)，將各變量?jī)蓛芍g進(jìn)行相關(guān)性分析。同時(shí)，利用受試者工作特征曲線(Receiver-operating-characteristic，ROC)分析PP2A對(duì)膿毒癥的診斷效率。
　　2.將膿毒癥患者血液中粒細(xì)胞PP2A、PLD1、JNK蛋白表達(dá)與健康志愿對(duì)照者進(jìn)行對(duì)比，觀察是否存在某種關(guān)聯(lián)性。
　　3.利用人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株（Human acute monocytic leukemia，THP-1），經(jīng)脂多糖(

11、Lipopolysaccharide，LPS)刺激，模擬膿毒癥環(huán)境，應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western-blot，WB)、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)，檢測(cè)PP2A、PLD1及JNK的表達(dá)并測(cè)定JNK活性及三者之間的相互作用。
　　4.利用LPS刺激THP-1細(xì)胞后，采用siRNA(Small interfering RNA)阻斷PP2A表達(dá)，檢測(cè)JNK信號(hào)通路、JNK活性及PLD1表

12、達(dá)，以進(jìn)一步說(shuō)明三者在通路中可能的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　1.膿毒癥患者PP2A的蛋白及mRNA表達(dá)高于非膿毒癥患者或健康對(duì)照者。此外，c-jun/JNK蛋白及mRNA表達(dá)隨著PP2A表達(dá)增高而明顯減弱。在發(fā)病的第1d、7d，PP2A表達(dá)與LOS、SOFA和MOD分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。ROC曲線分析提示，在本次實(shí)驗(yàn)中，PP2A分辨膿毒癥與非膿毒癥的敏感度是87.5％。
　　2.檢測(cè)膿毒癥患者與健康對(duì)照者PP2A、PLD1、J

13、NK蛋白表達(dá)，在健康對(duì)照組中PLD1、JNK表達(dá)正常，而PP2A表達(dá)減弱或消失。在膿毒癥組中則相反，PP2A明顯表達(dá)，對(duì)應(yīng)PLD1、JNK表達(dá)明顯減弱或消失。提示三者在膿毒癥中可能存在一定關(guān)聯(lián)性。
　　3.在THP-1細(xì)胞株中，利用Co-IP檢測(cè)了PP2A、PLD1及JNK三者關(guān)系，結(jié)果顯示三者之間存在著相互作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)JNK活性在細(xì)胞株感染了LPS后下降，提示三者在膿毒癥發(fā)生機(jī)制中共同發(fā)揮作用。
　　4.經(jīng)LPS感染的T

14、HP-1細(xì)胞株，利用siRNA阻斷PP2A表達(dá)后，PLD1、JNK蛋白表達(dá)及JNK活性恢復(fù)。
　　結(jié)論:
　　1.在膿毒癥中，PP2A負(fù)性調(diào)節(jié)JNK信號(hào)通路，是潛在的生物標(biāo)志物。
　　2.在膿毒癥中，PP2A、PLD1、JNK三者相互作用存在一定關(guān)聯(lián)性。
　　3.在膿毒癥期，JNK信號(hào)通路受抑制與蛋白PP2A、PLD1所起的作用有關(guān)聯(lián)。其中，蛋白PP2A發(fā)揮主導(dǎo)作用?？赡艽嬖谝粭l由PP2A介導(dǎo)，PLD1參與調(diào)節(jié)J