頜骨骨纖維異常增殖癥骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及Gs α基因突變分析.pdf

1、目的:
　　 骨纖維異常增殖癥(fibrous dysplasia of bone,FD),是一種良性骨纖維組織病損。Robey等認(rèn)為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)激活型Gsα基因發(fā)生錯(cuò)義突變是導(dǎo)致FD的原因,FD的治療方法很大程度上依賴于對(duì)BMSC生物功能及其如何控制骨再生的研究,因此,從骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中提取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并測(cè)定其Gsα基因的編碼基因位點(diǎn)進(jìn)行突變分析

2、具有重要理論意義和實(shí)際價(jià)值。
　　 本實(shí)驗(yàn)以上述研究結(jié)果為基礎(chǔ)探討一種從FD病變標(biāo)本中分離、培養(yǎng)BMSC的有效方法,為研究FD的病因和發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ),并對(duì)骨纖維發(fā)育異常的病因?qū)W作初步研究,探討一種關(guān)于頜骨骨纖維異常增殖癥(FD)患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的Gsct蛋白編碼基因位點(diǎn)突變分析的方法驗(yàn)證頜骨骨纖維異常增殖癥的基因突變類型。
　　 方法:
　　 1.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

3、頜骨FD患者經(jīng)X線及組織病理學(xué)確診,術(shù)中取組織標(biāo)本將其剪碎后沖洗獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察細(xì)胞的形態(tài),2.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性分析檢測(cè)獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)標(biāo)志物并用MTT法測(cè)定BMSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 3.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定將獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化,觀察其細(xì)胞形態(tài),用鈣鈷法檢測(cè)堿性磷酸酶活性并用茜素紅染色法檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況。

4、>　　 4.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞Gsα基因型分析從獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞提取細(xì)胞DNA,通過(guò)定向誘導(dǎo)突變,巢式PCR及限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切等方法將突變基因擴(kuò)增,并進(jìn)行基因序列測(cè)定。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞密集生長(zhǎng)處呈現(xiàn)旋渦狀,傳代后細(xì)胞均呈漩渦狀生長(zhǎng),排列整齊,多呈長(zhǎng)梭形或多角形,進(jìn)一步純化后,細(xì)胞形態(tài)趨于長(zhǎng)梭形。
　　 2.99％的細(xì)胞表達(dá)CD44和HL

5、A-ABC,不表達(dá)CD34.由生長(zhǎng)曲線可見(jiàn):傳代培養(yǎng)的潛伏期為24h,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期出現(xiàn)在第3-4天,5天后細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期。
　　 3.BMSC細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化后,呈現(xiàn)成骨細(xì)胞形態(tài),三角形、多角形,鈣-鈷法行堿性磷酸酶染色,可見(jiàn)大部分細(xì)胞內(nèi)呈陽(yáng)性反應(yīng),經(jīng)茜素紅染色后可見(jiàn)有形成的鈣結(jié)節(jié)。
　　 4.頜骨FD患者的BMSC中Gsα第201位氨基酸的編碼基因突變G→A或C→T,造成第201位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸或精氨酸突