正常受精、克隆與轉(zhuǎn)基因牛的成纖維細胞microRNA表達譜分析.pdf

1、機體維持正常的生理機能和健康，需要控制體內(nèi)代謝平衡。一些重要的轉(zhuǎn)錄因子可以直接或間接的影響營養(yǎng)和代謝鏈，如膽固醇、脂質(zhì)、葡萄糖和胰島素等可以快速改變基因表達的程序，從而維持代謝平衡。microRNAs（miRNAs）可以調(diào)控動物多種生理生化活動，在基因表達的轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平表現(xiàn)為重要的調(diào)控分子，miRNAs可能也參與調(diào)控體細胞克隆動物和轉(zhuǎn)基因克隆動物的表觀遺傳。
　　利用Solexa測序技術(shù)，分別檢測并分析2頭體內(nèi)受精(in

2、vivofertilization，F(xiàn)erti)牛、2頭克隆牛(somatic cell nuclear transfer，SCNT)和2頭轉(zhuǎn)fat-1基因牛（transgenic，TG）的成纖維細胞中的miRNA表達譜，共建立了6個miRNAs文庫。利用Mireap軟件，分析miRNA的表達差異，探討成纖維細胞中miRNAs的表達規(guī)律，并預(yù)測了差異miRNAs調(diào)控的靶基因。通過基因GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫富集分析和全基

3、因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路分析，研究了這些靶基因參與的生物學(xué)通路，初步揭示了體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)基因來源的牛中的miRNA表達和靶向基因之間的關(guān)系。
　　結(jié)果表明:
　　1.運用miRNAs測序技術(shù)，共檢測了367個已知miRNAs，其中83個、19個和23個已知miRNAs分別在體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛中特異性表達，14個已知miRNAs在三者中共同表達;新發(fā)現(xiàn)了178個數(shù)據(jù)庫未公布的miRNAs，其中1

4、7個、1個和4個新的候選miRNAs分別在體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛中特異性表達，1個新的候選miRNA在三者中共同表達。
　　2.通過篩選體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛成纖維細胞中的差異表達miRNA，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞中存在一系列上調(diào)和下調(diào)的miRNA。通過Real time RT-PCR方法檢測、驗證和比較體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)基因組三組中表達量前10個miRNA的差異，同時對表達量高的2個新的候選miRNA進行熒光定量

5、PCR驗證，并預(yù)測部分高表達的候選miRNA結(jié)構(gòu)。GO富集分析和KEGG通路分析顯示，差異表達miRNA對應(yīng)靶基因顯著富集的通路主要在代謝通路、MAPK信號通路、鈣離子信號通路、嘌呤代謝通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路、嘧啶代謝通路和細胞周期通路等7個生物學(xué)通路。
　　3.通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測FGF10、LPL和ATGL可能作為bta-miR-21的靶基因，熒光定量PCR驗證后發(fā)現(xiàn)，與克隆牛和轉(zhuǎn)基因牛成纖維細胞相比，F(xiàn)GF10和AT

6、GL的mRNA在體內(nèi)受精牛成纖維細胞中表達顯著降低，而bta-miR-21在體內(nèi)受精牛成纖維細胞中表達顯著升高，初步認為bta-miR-21與FGF10和ATGL的表達存在負調(diào)控的關(guān)系。
　　4.microRNA的功能鑒定。利用在體外水平過表達或敲減bta-miR-21，檢測靶基因的表達變化，進一步證明bta-miR-21與FGF10和ATGL的靶向關(guān)系，bta-miR-21可能通過調(diào)控FGF10和ATGL的表達發(fā)揮作用。

7、　　結(jié)論:
　　1.本研究建立了遺傳背景一致，不同來源胚胎（體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛）成纖維細胞的miRNA文庫，獲得了可能影響克隆、轉(zhuǎn)基因克隆后代發(fā)育的miRNA信息，為深入揭示克隆與轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育異常的機制提供了重要參考。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL在體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛胎兒成纖維細胞中具有調(diào)控作用，推測bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATG