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文檔簡介
1、氧化溶血實(shí)驗(yàn)是一種常用的抗氧化評價方法,通過分光光度法檢測紅細(xì)胞的膜損傷破裂情況以此反映抗氧化活性。然而,氧化溶血模型在使用時受到諸多反應(yīng)條件與檢測條件的影響,使抗氧化活性評價結(jié)果存在偏差。因此,全面系統(tǒng)地研究紅細(xì)胞氧化溶血模型在方法學(xué)發(fā)展中具有重要意義。
在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氧化溶血實(shí)驗(yàn)存在檢測結(jié)果偏低的陰性溶血現(xiàn)象,嚴(yán)重干擾抗氧化活性的評價。為此,本文以H2O2為氧化劑建立不同氧化等級的紅細(xì)胞模型,通過聯(lián)用熒光法與分光光度法檢
2、測溶血現(xiàn)象,并設(shè)計(jì)血紅蛋白干擾檢測實(shí)驗(yàn)以剖析陰性溶血現(xiàn)象的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞在氧化溶血的同時血紅蛋白也參與氧化反應(yīng)并發(fā)生降解,血紅蛋白的這一降解過程就是陰性溶血的原因。
為校正因氧化性溶血引起的結(jié)果偏低現(xiàn)象,以H2O2氧化血紅蛋白為模型,用ICP光譜法、熒光法分析反應(yīng)產(chǎn)物的特性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血紅蛋白釋放的鐵離子與蛋白類物質(zhì)結(jié)合形成不同有機(jī)物;而血紅蛋白的熒光產(chǎn)物中含有一部分穩(wěn)定的物質(zhì)可用于校正血紅蛋白吸光度。H2O2在一定劑量范
3、圍內(nèi)氧化血紅蛋白所得的熒光數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換,建立氧化溶血實(shí)驗(yàn)中血紅蛋白吸光度的校正公式:Hbactual=Abs+FI/6.436。
參考體內(nèi)溶血條件通過比較培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)時間、細(xì)胞密度等反應(yīng)條件,確定更為合理的紅細(xì)胞體外氧化體系,即培養(yǎng)基為RPMI1640,細(xì)胞密度為2×109個/mL,H2O2劑量為166.5μmol/mL,反應(yīng)時間為24h。
紅細(xì)胞氧化實(shí)驗(yàn)中常使用抗氧化活性物質(zhì)預(yù)培養(yǎng)的操作模式,本文為深入分析預(yù)
4、培養(yǎng)模式(R1)中包含的潛在活性途徑特將此模式拓展(R1、R2、R3),設(shè)計(jì)三種投料順序以觀察溶血、ROS、MDA、metHb等指標(biāo)在三種模式中的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組和樣品組在三種模式中的評價結(jié)果確實(shí)不同。
基于修正的溶血檢測方法以及紅細(xì)胞氧化模型,本文評價了新合成肽IWHDC的抗氧化活性。結(jié)果表明IWHDC可直接清除H2O2,在R1、R3模式中表現(xiàn)出抗氧化溶血作用;紅外光譜結(jié)果表明蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化是本文紅細(xì)胞氧化模型發(fā)
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