GSTM3基因表達水平及甲基化與腎透明細胞癌發(fā)生及其轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、[目的]檢測腎透明細胞癌(ccRCC)中GSTM3基因表達水平及其啟動子區(qū)CpG島的甲基化情況,探討GSTM3基因表達和甲基化與ccRCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 [方法]以前期本實驗室采用cDNA基因表達譜芯片研究本實驗室建立的漢族人能夠無限傳代的2株在動物模型中證實具有轉(zhuǎn)移潛能的RCC細胞系(RCC05-TXJ、RCC05-ZYJ)基因表達譜中發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移細胞株中表達水平下調(diào)的GSTM3基因為興趣基因,根據(jù)GenBank中公布的GS

2、TM3基因的編碼區(qū)序列,用Primer Premier 5.0及Oligo 6.0軟件設(shè)計該基因RT-PCR引物,采用半定量RT-PCR檢測在ccRCC高轉(zhuǎn)移潛能細胞系(RCC05-TXJ)、低轉(zhuǎn)移潛能細胞系(RCC05-ZYJ)中GSTM3基因的表達水平。同樣采用半定量RT-PCR檢測24例原位ccRCC及其癌旁“正?！蹦I組織和14例ccRCC轉(zhuǎn)移組織的GSTM3基因的表達水平。ccRCC轉(zhuǎn)移和原位腫瘤標本均來源于2004年1月至20

3、07年9月長海及長征醫(yī)院泌尿外科腎癌根治手術(shù)的患者以及長征醫(yī)院骨科轉(zhuǎn)移癌切除標本,共采集38例,其中。腎原位腫瘤24例,骨轉(zhuǎn)移7例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例及肝轉(zhuǎn)移2例。男性25例,女性13例,平均年齡為50.3歲,最小年齡為45歲,最大為73歲,經(jīng)病理證實,均為腎透明細胞癌。用去甲基化劑5-Aza-CdR(5-aza-deoxycytidine,5-雜糖-胞苷)干預(yù)低轉(zhuǎn)移潛能細胞系(RCC05-ZYJ),采用半定量RT-PCR檢測處理前后GST

4、M3基因的表達水平變化。用生物信息學(xué)方法分析GSTM3基因啟動子區(qū)CpG島情況,采用MethPrimer、BiSearch和Methyl Primer Express(R) Software v1.0軟件設(shè)計巢式BSP(nested bisulfite Sequencing PCR)引物,提取10例原位ccRCC及其癌旁。腎組織基因組DNA,按照Trygve O.Tollefsbol等的方法進行基因組DNA亞硫酸氫鈉修飾,巢式BSP后產(chǎn)

5、物凝膠回收,與pMD18-T載體連接,經(jīng)α篩選后轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細胞,菌液送測序。根據(jù)測序所得甲基化位點情況,采用MethPrimer、BiSearch和Methyl Primer Express(R) Software v 1.0軟件設(shè)計巢式MSP(nested methylation specific PCR)引物,采用巢式MSP檢測10例原位ccRCC及其癌旁腎組織、8例ccRCC轉(zhuǎn)移組織甲基化情況。 [結(jié)果]RCC05

6、-TXJ中GSTM3基因表達強度低于RCC05-ZYJ。24例原位ccRCC及其癌旁“正?！蹦I組織中,GSTM3基因在原位ccRCC中表達下調(diào)例數(shù)(17例),多于非表達下調(diào)例數(shù)(7例),p=0.04。轉(zhuǎn)移組織與原位ccRCC比較時,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移組織中GSTM3基因表達水平下調(diào)的現(xiàn)象。5-Aza-CdR處理RCC05-ZYJ后,GSTM3基因表達強度高于處理前。10例原位ccRCC及其癌旁和8例轉(zhuǎn)移組織中,癌組織GSTM3基因啟動子甲基化陽性

7、為4例,癌旁組織2例(P=0.628),轉(zhuǎn)移組織1例(P=0.314),差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 [結(jié)論]GSTM3基因的表達水平與ccRCC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),該基因的啟動子甲基化是影響該基因表達水平的主要原因之一。去甲基化劑5-Aza-CdR可以去除GSTM3基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài),從而恢復(fù)GSTM3基因表達。初步明確了ccRCC中GSTM3基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化位點,為確定ccRCC易感性遺傳標記及尋找ccRC