惡性瘧原蟲(chóng)重組蛋白次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-黃嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶免疫原性及免疫保護(hù)作用的研究.pdf

1、瘧疾目前仍然是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的寄生蟲(chóng)病,據(jù)WHO最新估計(jì),全球仍有41％的人生活在瘧疾流行區(qū),每年死亡人數(shù)達(dá)三百萬(wàn)。 隨著瘧原蟲(chóng)及其蚊媒的抗藥性日益增強(qiáng),迫切需要研制高效的瘧疾疫苗。但由于瘧原蟲(chóng)生活史復(fù)雜、抗原變異性大等原因,單價(jià)疫苗免疫效果并不理想。因此,研青《復(fù)合多價(jià)疫苗成為預(yù)防瘧疾的一條潛在的有效途徑。而多價(jià)疫苗應(yīng)包含瘧原蟲(chóng)的多個(gè)能夠發(fā)揮保護(hù)性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答作用的抗原表位(T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位),以更有效地

2、發(fā)揮免疫保護(hù)作用。但近年來(lái)所發(fā)現(xiàn)的針對(duì)紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)感染的保護(hù)性抗原,絕大多數(shù)是針對(duì)保護(hù)性體液免疫的抗原。目前已鑒定了具有細(xì)胞免疫保護(hù)作用的抗原組分一惡性瘧次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-黃嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guanine xanthine phosphoribosyl transferase,HGXPRT)。HGXPRT是嘌呤核苷酸補(bǔ)救合成途徑中的一種酶。這種酶具有高度保守性,在哺乳動(dòng)物及瘧原蟲(chóng)體內(nèi)均存在,可催化5-磷酸

3、核糖焦磷酸(PRPP)與嘌呤反應(yīng)生成嘌呤核苷酸。 本實(shí)驗(yàn)室已利用畢氏酵母系統(tǒng)表達(dá)并純化了惡性瘧HGXPRT重組蛋白,本研究在此基礎(chǔ)上,檢測(cè)HGXPRT重組蛋白對(duì)約氏瘧易感小鼠(C57BL/6小鼠)的免疫原性；對(duì)不同約氏瘧蟲(chóng)株(P.yoelii17XL和P.yoelii17NL)感染的免疫保護(hù)作用；建立針對(duì)HGXPRT蛋白特異的T細(xì)胞品系,以確定其保護(hù)性細(xì)胞免疫的作用；從而為瘧疾疫苗的研制提供基礎(chǔ)資料。 為研究HGXPRT

4、重組蛋白的免疫原性,我們將HGXPRT重組蛋白與完全弗氏佐劑(complete freud's adjuvant CFA)乳化并免疫C57BL/6小鼠,并以不完全弗氏佐劑(incomplete freud's adjuvant IFA)乳化蛋白加強(qiáng)免疫兩次,設(shè)立小牛血清白蛋白(bovine serum albumin BSA)和PBS組作為對(duì)照組,并在每次免疫的前一天尾靜脈取血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清抗HGXPRT重組

5、蛋白抗體滴度；我們還將HGXPRT重組蛋白與CFA乳化并免疫Balb/c小鼠,設(shè)立BSA和PBS組作為對(duì)照組。加強(qiáng)免疫一次后,無(wú)菌取小鼠脾臟、淋巴結(jié),制備淋巴細(xì)胞懸液,通過(guò)[3H]標(biāo)記的胸腺嘧啶摻入法來(lái)檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖；采用流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴細(xì)胞的表面分子(CD4,CD8)的表達(dá)及細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的分泌情況。 ELISA結(jié)果顯示：三次免疫的抗HGXPRT蛋白抗體滴度依次升高,至末次免疫時(shí)可達(dá)105以上(1.89×1

6、05)(與PBS組比較,P<0.05);淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)HGXPRT重組蛋白刺激的淋巴細(xì)胞能夠發(fā)生增殖(與PBS組比較,P<0.05);通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)重組HGXPRT蛋白刺激后的淋巴細(xì)胞為能夠分泌IFN-γ、CD4+的Th1型淋巴細(xì)胞(>80％)。 為檢測(cè)重組HGXPRT蛋白的免疫保護(hù)作用,我們用P.yoelii 17XL和P.yoelii17NL分別感染經(jīng)第三次加強(qiáng)免疫10天后的C57BL/6小鼠,在感染后次

7、日起每日計(jì)數(shù)原蟲(chóng)率和小鼠生存時(shí)間。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,重組HGXPRT蛋白能夠抑制P.yoelii17NL在小鼠體內(nèi)的增殖,延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間,提高生存率；但對(duì)P.yoelii17XL,在本實(shí)驗(yàn)中重組HGXPRT蛋白未顯示出明顯的免疫保護(hù)作用(P>0.1)。 為研究重組HGXPRT蛋白的保護(hù)性細(xì)胞免疫作用,我們建立了HGXPRT特異性的T細(xì)胞系及對(duì)照組BSA特異的T細(xì)胞系。對(duì)于P.yoelii17XL,我們采用SCID小鼠進(jìn)行過(guò)

8、繼免疫攻擊實(shí)驗(yàn)。以BSA特異的T淋巴細(xì)胞組、PBS組為對(duì)照組,結(jié)果表明：三組小鼠原蟲(chóng)率均急速上升,原蟲(chóng)率及生存時(shí)間組間比較無(wú)明顯差異(P>0.1)。提示重組蛋白HGXPRT特異的T細(xì)胞品系對(duì)P.yoelii17XL感染的SCID小鼠無(wú)明顯的保護(hù)作用。 對(duì)于P.yoelii17NL,我們分別采用裸鼠和NOD-SCID開(kāi)展了過(guò)繼免疫攻擊實(shí)驗(yàn)。BSA特異的T淋巴細(xì)胞組、PBS組為對(duì)照組,裸鼠和NOD-SCID小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組原

9、蟲(chóng)率上升急速,峰值出現(xiàn)早,生存時(shí)間短,而HGXPRT組原蟲(chóng)率上升較為平緩,峰值出現(xiàn)晚,生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05)。結(jié)果表明重組HGXPRT蛋白特異CD4+Th1細(xì)胞系能夠?qū)Ω腥緋.yoelii17NL的小鼠產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫的作用。 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)室用畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的惡性瘧重組HGXPRT蛋白,具有一定的免疫原性,能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體,而且能夠介導(dǎo)對(duì)感染P.yoelii17NL的小鼠產(chǎn)生c