細胞色素P450基因多態(tài)性與散發(fā)性阿爾茨海默病的相關研究.pdf

1、研究目的:
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是一種以進展性認知功能障礙和記憶能力損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也是大腦變性疾病中最常見的疾病，多發(fā)于老年人，發(fā)病率隨年齡的增加而增加。在65歲以上人群中，西方國家約有5％的人罹患此病，85歲以上老年人患病率高達47％～50％，我國在60歲以上人群中AD的患病率為3％～5％。在發(fā)達國家，AD已成為繼癌癥、心血管疾病、中風之后的第四大死因。我國

2、從20世紀90年代起，提前進入人口老齡化的行列，60歲以上的老人已達1.26億，占全國人口的10％，并以年均3.3％的速度上升。據(jù)估計到2025年我國60歲以上老年人將達2.8億，占全國總?cè)丝诘?8.4％，屆時將有1009萬的AD患者。AD的病情呈進行性發(fā)展，但由于目前尚無特效的治療藥物或方法，患者通常在確診后的3-9年內(nèi)不治身亡。隨著我國社會老齡化的日趨明顯以及人均壽命的不斷提高，AD對人類生命健康的威脅日益突出。
　　 AD

3、的病理學特征包括，大腦神經(jīng)細胞外大量β-淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉積形成的老年斑、皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)、皮質(zhì)細胞減少、血管淀粉樣變性、炎性浸潤以及氧化損傷等。有關AD發(fā)病機制的學說眾多，如蛋白異常學說、基因突變學說、突觸失活學說、線粒體功能紊亂學說、炎癥反應學說、鈣平衡失調(diào)學說等。但到目前為止，其確切的病因及發(fā)病機制尚不清楚，一般認為是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，是一種多基因

4、相關疾病，具有明顯的家族聚集性，遺傳因素在其發(fā)病中起重要作用。隨著分子生物學的迅速發(fā)展及人類基因組計劃的進行，尋找AD的遺傳易感基因并從基因水平闡明其發(fā)病機制成為醫(yī)學研究的熱點。大規(guī)模篩查AD的遺傳易感基因?qū)τ陂_展針對性的人群預防，延緩或防止AD的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
　　 到目前為止，已有一些基因被證實與AD的發(fā)病密切相關，如21號染色體的淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein，APP)基因、14

5、號染色體的早老素1基因（presenilin-1，PS-1）和1號染色體的早老素2基因（presenilin-2，PS-2）被認為與早發(fā)型家族性AD相關，而載脂蛋白Eε4(Apolipoprotein Eε4，APOEε4)被公認為與家族性和散發(fā)性AD都相關。
　　 最近的研究表明，腦內(nèi)細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)及其底物和代謝終產(chǎn)物可能參與了AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程。CYP為一類亞鐵血紅素

6、-硫醇鹽蛋白的超家族，在哺乳動物中主要存在于微粒體和線粒體中，參與大量的外源性物質(zhì)（藥物、化學毒物、致癌物等）和內(nèi)源性物質(zhì)（類固醇激素、維生素D、膽酸等）的代謝過程。在人類大腦，CYP參與的代謝途徑中，至少有兩條途徑的多種內(nèi)源性物質(zhì)與AD的發(fā)病密切相關。第一條途徑是膽固醇代謝及類固醇激素的生成途徑。腦是體內(nèi)膽固醇含量最高的組織，其膽同醇含量占人體總含量的20％，而腦組織本身只占人體質(zhì)量的2％。膽固醇為合成神經(jīng)細胞膜所必需，在髓鞘內(nèi)含量很

7、高，并形成脂質(zhì)筏，后者是裝配β和γ分泌酶及將APP加工為Aβ的平臺。當酯化膽固醇過多時，膜脂轉(zhuǎn)運減少，可致Aβ生成和聚集增多而清除減少，導致AD發(fā)生。由于膽固醇不能通過血腦屏障，必須通過CYP46A1將其代謝為24s-羥基膽甾醇才能與外周進行交流，因此，CYP46A1的功能狀態(tài)直接影響了腦內(nèi)膽固醇的水平，從而有可能參與了AD的發(fā)病過程。另外，膽固醇還可以在CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1等一些關鍵酶的作用下，生成一系列與A

8、D密切相關的類固醇激素，如妊娠素可以改善認知障礙，脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)可以促進神經(jīng)元的存活和分化、同時還具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用，雌激素則具有防止神經(jīng)元的死亡、選擇性地增加神經(jīng)元的可塑性以及減少Aβ在腦內(nèi)的沉積等神經(jīng)保護作用。因此，CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1這些關鍵酶的表達及活性必然有可能通過影響了上述類固醇激素的生成，從而參與了AD的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 另外一

9、條是花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)經(jīng)CYP表氧化酶途徑代謝的通路。大量的研究表明，AD的發(fā)生發(fā)展通常伴隨著慢性炎癥反應，而CYP表氧化酶則能把體內(nèi)的AA代謝成具有很強抗炎特性的環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)，更重要的是，在AD患者的大腦中，其CYP表氧化酶的mRNA及蛋白表達水平比健康人群顯著下降，因此，CYP表氧化酶的表達下降或功能缺失有可能參與了AD的發(fā)生發(fā)展過

10、程。在人體內(nèi)，參與EETs代謝的CYP表氧化酶主要有CYP2J2、CYP2C8和CYP2C9。除了CYP2C9并未見在腦內(nèi)有表達的報道，CYP2J2和CYP2C8均在大腦的多個組織中有豐富的表達，其中大腦皮層、額葉和海馬區(qū)的表達量最高，這些表達部位與AD患者腦內(nèi)Aβ的分布相吻合。綜上所述，本研究最終選取了參與膽固醇代謝及類固醇生成的關鍵酶CYP46A1、CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1，參與AA代謝生成EETs的關鍵酶CY

11、P2C8和CYP2J2，總共6個基因的12個多態(tài)性位點，然后采用病例-對照的方法，探討這些基因多態(tài)性與中國漢族人群散發(fā)性阿爾茨海默病的相關性。此外，由于APOE基因ε4等位基因為目前所公認的散發(fā)型和遲發(fā)型阿爾茨海默癥的危險因素，本研究打算選取該基因型作為分層因素，進一步探討以上的CYP多態(tài)性位點與散發(fā)性AD的關系。
　　 研究對象:
　　 本研究在廣州市老人院、廣州市腦科醫(yī)院和廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院收集散發(fā)性AD患者和健康對

12、照者的外周血標本，共收集到AD病例組207個例，健康對照組256例，經(jīng)統(tǒng)計學分析，AD組與健康對照組年齡和性別匹配，具有可比性。
　　 1.AD受試患者入選標準:①年齡≥65歲，漢族，無血緣關系;
　　 ②簡易精神狀態(tài)檢查(MMSE)評分文盲≤17分，小學≤20份，中學及以上≤24分;
　　 ③根據(jù)美國精神病學會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第Ⅳ版(DSM-Ⅳ)標準(American PsychiatricAssoci

13、ation2000)診斷有阿爾茨海默型的癡呆;
　　 ④根據(jù)美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)的標準臨床診斷為可能的AD患者。
　　 排除標準:①血管性癡呆及系統(tǒng)性疾病和物質(zhì)中毒所致的癡呆;
　　 ②抑郁導致的假性癡呆;
　　 ③合并其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腦血管疾病;
　　 ④正處于心血管、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者及惡性腫瘤患者。

14、
　　 2.健康對照者納入標準:①年齡≥70歲，漢族，無血緣關系;
　　 ②MMSE評分正常無癡呆;
　　 ③無腦血管病及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病;
　　 排除標準:①確診惡性腫瘤患者;
　　 ②正處于心血管、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者。
　　 研究方法:
　　 實驗對象空腹8小時以上，靜脈抽取5ml外周血置于EDTA-K2抗凝管中，按人血液DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DN

15、A，然后采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術進行基因型分析。同時收集每一例受試者的總膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇(high densityliprotein eholesterol，HDL-C)等相關的臨床指標。
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPS

16、S13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，采用雙側(cè)t檢驗比較AD組與對照組符合正態(tài)分布的計量資料;等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律、組間的基因型頻率以及等位基因頻率分析均采用x2檢驗，危險因素分析采用多元logistic回歸分析;連鎖不平衡(Linkage disequilibrium，LD)分析采用Haploview4.2軟件，單體型分析采用PHASE2.0分析軟件;以雙側(cè)P＜0.0

17、5為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用飛行時間質(zhì)譜技術對207例散發(fā)性AD患者和239例健康對照者的基因組DNA進行ApoEε4(rs429358，rs7412)、CYP46A1(rs3783320，rs3742376)、CYP11A1(rs4887139, rs11638442)、CYP17A1(rs3824755, rs743572)和CYP19A1(rs3751592，rs1065778)基因分型，結(jié)

18、果顯示:①APOEε4基因型在AD組中的分布頻率明顯高于對照組，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。②通過對各CYP亞型的基因型和等位基因分析，我們發(fā)現(xiàn)CYP17A1-rs3824755的基因型(GGvs.GC+CC)在AD組與對照組中的分布具有統(tǒng)計學差異(P=0.044)，表現(xiàn)為保護作用;CYP19A1-rs3751592的A等位基因和基因型(AAvs.AG+GG)在兩組間的分布有統(tǒng)計學差異(P=0.042，P=0.036)，兩者

19、均增加了AD的發(fā)病風險。③當以是否攜帶APOEε4進行分層分析后發(fā)現(xiàn)，CYP17A1-rs3824755的G等位基因在APOEε4攜帶者的人群中對AD起保護作用(P=0.001);CYP17A1-rs743572的A等位基因在APOEε4攜帶者的人群中增加了AD的發(fā)病風險(P=0.037); CYP19A1-rs3751592的A等位基因在APOEε4攜帶者與非攜帶者人群中均增加了AD的發(fā)病風險(P=0.004，P=0.002)，同時，

20、其基因型(AAvs.AG+GG)在APOEε4攜帶者的人群中也增加了AD的發(fā)病風險(P=0.006)。④在單體型分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，CYP46A1的單體型G-C在兩組中分布有統(tǒng)計學差異(P=0.050)，表現(xiàn)為保護作用。當以是否攜帶APOEε4進行分層分析，發(fā)現(xiàn)在攜帶ApoEε4的人群中，CYP46A1的單體型G-C和CYP17A1的單體型C-G對AD具有保護作用(P=0.038，P=0.001)，而CYP17A1的單體型G-A和CYP19

21、A1單體型A-G則增加了AD的發(fā)病風險(P=0.037，P=0.004)。⑤采用logistic回歸分析排除傳統(tǒng)危險因素的影響之后發(fā)現(xiàn)，只發(fā)現(xiàn)ApoEε4為AD的風險因素，但未發(fā)現(xiàn)任何CYP的SNPs位點與AD發(fā)病存在相關性。
　　 2.采用飛行時間質(zhì)譜技術對206例散發(fā)性AD患者和256例健康對照者的基因組DNA進行ApoEε4(rs429358，rs7412)、CYP2C8(rs1058392，rs2275622)和CYP2

22、J2(rs1155002，rs2271800)基因分型，結(jié)果顯示:①APOEε4基因型在AD組中的分布頻率明顯高于對照組，兩組間具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。②通過對各CYP亞型的基因型和等位基因分析，我們未發(fā)現(xiàn)任何CYP的SNPs位點與AD發(fā)病存在相關性;而當以是否攜帶APOEε4進行分層分析后發(fā)現(xiàn)，在攜帶ApoEε4的人群中，CYP2J2-rs1155002的C等位基因和基因型(CC vs.CT+TT)在兩組間的分布均有統(tǒng)計學差

23、異(P=0.044，P=0.044)，并均表現(xiàn)為保護作用。③在單體型的分析中發(fā)現(xiàn)，CYP2C8的單體型C-T增加了AD的發(fā)病風險(P＜0.001)，而單體型T-C降低了AD的發(fā)病風險(P＜0.001);而在攜帶ApoEε4的人群中，CYP2C8的單體型C-T增加了AD的發(fā)病風險(P=0.009)，CYP2C8的單體型T-C和CYP2J2的單體型A-T則降低了AD的發(fā)病風險(P=0.023，P=0.044);在ApoEε4非攜帶者人群中，

24、CYP2C8的單體型的發(fā)病風險與總體人群分析結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.ApoEε4增加中國漢族散發(fā)性AD的發(fā)病風險。
　　 2.CYP19A1-rs3751592的A等位基因和基因型(AA vs.AG+GG)增加了中國漢族散發(fā)性AD的發(fā)病風險。
　　 3.CYP46A1(rs3783320，rs3742376)單體型G-C降低了中國漢族散發(fā)性AD的發(fā)病風險。
　　 4.CYP2C8(rs