首次接種羊輪狀病毒疫苗的排毒研究.pdf

1、背景和目的：
　　 輪狀病毒(rotavirus，RV)自1973年發(fā)現(xiàn)后，就被廣泛認為是導致兒童急性腹瀉的主要病原體，5歲以下的兒童幾乎全部感染過輪狀病毒。全球每年因輪狀病毒導致的腹瀉疾病占因腹瀉而住院兒童的39％(22～55％)，并造成約611，000(454，000～705，000)兒童的死亡，其中多數死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。中國是世界上第二大人口出生國，每年因為輪狀病毒感染導致的兒童死亡總數也排名世界第二。我國因重癥腹瀉住

2、院的兒童中有41％的大便標本檢測為輪狀病毒陽性，每年發(fā)生輪狀病毒性腹瀉的兒童有1700萬人，并導致38405人的死亡，占世界輪狀病毒性腹瀉死亡的8％。
　　 目前還沒有針對輪狀病毒腹瀉的特效治療，因此研發(fā)輪狀病毒疫苗變得至關重要。羊輪狀病毒疫苗(LLR)由蘭州生物制品研究所研制，該疫苗于1985年從當地的一只羔羊分離出來并由牛腎細胞經過37代的減毒培養(yǎng)培養(yǎng)而來。LLR為單價減毒活疫苗，屬A組輪狀病毒，基因型為G10P[15]。該

3、疫苗于2000年獲批上市，主要用來預防因輪狀病毒感染而導致的重癥腹瀉。自上市以來，每年大約有50萬兒童接種該苗。在一項臨床三期實驗中，LLR產生的相關抗體產生率為60％，但是未對疫苗保護效果(vaccine，VE)進行評價。一項1∶1配對病例對照研究中，研究者調查了2002～2004年中的838對兒童，表明該疫苗的疫苗保護效果為73.3％（95％可信區(qū)間:61.2～81.6％）。
　　 輪狀病毒疫苗接種方式為口服減毒或滅活的疫苗

4、，部分疫苗毒株會隨著排泄物排出體外，造成疫苗的排毒現(xiàn)象。幾乎所有的輪狀病毒疫苗，不論是減毒活疫苗，還是重組疫苗，均能產生輪狀病毒排毒。各種輪狀病毒疫苗都可引發(fā)排毒，但是排毒發(fā)生概率不等，差別很大，且排毒量和排毒持續(xù)時間也不一致。一般來說排毒發(fā)生在服苗后1～10天，排毒量在104～107pFU/ml，所以建議免疫力低下或免疫力缺失者避免同服用輪狀病毒疫苗14天內的兒童接觸。在排毒的傳染性方面，傳統(tǒng)的四價恒河猴疫苗比目前常用的減毒單價疫苗和

5、重組疫苗要強;兒童和老年人比成年人更易受到疫苗排毒的感染。國外關于輪狀病毒疫苗的排毒研究的報道比較多，由于羊輪狀病毒疫苗(LLR)沒進行大規(guī)模的臨床實驗，現(xiàn)有的科研人員對該疫苗的關注也主要是放在疫苗的安全評價和保護率方面，有關羊輪狀病毒疫苗的排毒情況以及傳染性方面的評價未見報道。
　　 本研究擬跟蹤調查首次接種羊輪狀病毒疫苗的兒童14天，收集調查對象每天的大便標本并進行輪狀病毒檢測，以確定疫苗的排毒率、排毒量和排毒時間;同時跟蹤

6、調查兒童服苗后的不良反應情況（如發(fā)熱、食欲減退、腹瀉、活動力減少、精神萎靡等）以及密切接觸的家庭成員是否發(fā)生因輪狀病毒疫苗排毒而導致的感染情況，旨在評價羊輪狀病毒疫苗的排毒情況以及傳染性。
　　 對象和方法
　　 1.研究對象研究對象來自2011年9月～2012年10月北京市豐臺區(qū)婦幼保健醫(yī)院保健科首次接種LLR的兒童。入選標準為首次接種輪狀病毒疫苗、年齡2～36月并由父母或監(jiān)護人簽字同意的健康兒童。排除標準為免疫力低下

7、或免疫缺失者、服苗前一周有過其他疫苗接種史者、服苗前一周有發(fā)熱和（或）腹瀉癥狀者以及有過輪狀病毒腹瀉史者。本研究通過了中國疾病預防控制中心病毒病預防和控制研究所倫理委員會的同意。
　　 2.疫苗和疫苗接種LLR為單價減毒活疫苗，屬A組輪狀病毒，基因型為G10P[15]?？诜啝畈《净钜呙缦挡捎幂啝畈《緶p毒株感染新生小牛腎細胞，經培育、收獲病毒液后加入時宜的甜味保護劑制成，為橙紅或粉紅色澄清液體。規(guī)格為每瓶1人份，每瓶劑量3.0m

8、l。每1ml疫苗所含活病毒量應不低于5.51gPFU/ml或(l)gCCID50。每次人用口服劑量為3.0ml。該疫苗主要用于2月～3歲嬰幼兒，每年服用一次，接種時間為每年的7～9月。
　　 3.研究設計依據本研究的納入和排除標準，采取當面詢問調查兒童家長的方式進行篩選對象。將可納入本研究的兒童信息在豐臺區(qū)保健科的EPI系統(tǒng)上進行核對，以確保家長反映的信息的正確性。一旦家長簽字同意參與本次調查研究，家長們將在調查員的指導下完成一

9、份問卷調查表的填寫。該問卷調查表包含接種疫苗兒童的基本信息、家庭情況、地址、聯(lián)系方式以及未來14天內大便標本收集情況和不良反應發(fā)生情況。然后由調查者發(fā)給家長14個大便標本塑料收集瓶、若干標簽紙和一份使用說明書。調查人員在隨后14天內聯(lián)系調查兒童家長，了解大便標本收集情況及不良反應發(fā)生情況，并按調查對象住址每天上門取一次大便標本。收集的標本置-20℃冰箱冷凍保存。標本收集情況和不良反應情況錄入電腦以供分析。
　　 4.大便標本的檢

10、測分析所有收集的大便標本將按調查兒童和調查天數進行歸類和排序。然后進行酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunoadsordent assay，EIA)檢測大便標本中是否含有輪狀病毒抗原。檢測試劑盒為英國Oxoid Ltd公司出品的輪狀病毒檢測試劑盒，該試劑盒有96個反應孔，一次可做94份標本。標本首先融解，然后取樣并加入病毒保存液溶解，最后按照EIA試劑盒說明書在反應孔中操作。結果在酶標儀上讀數，波長設定為450 nm。檢測

11、試標本OD值-陰性對照OD值≥0.2為判讀陽性結果。每次試驗至少設有一孔陽性對照和一孔陰性對照。
　　 5.逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)基因型分析采用RT-PCR法分別檢測EIA陽性兒童的標本以及部分隨機抽取的EIA陰性兒童標本的人輪狀病毒和羊輪狀病毒，以鑒定兒童輪狀病毒排毒的基因型。人輪狀病毒的引物由中國疾病預防控制中心病毒病研究所腹瀉病研究室提供;LLR基因片段全長在GenBank database上下載，運用pri

12、mer5.0進行引物設計。針對羊輪狀病毒分型，共設計了2對引物，一對用來鑒定G基因型，一對用來鑒定 P基因型。 G基因分型上游引物 LLR-VP7F，5，-TGAGTGGACGAGTACATTGT-3'，下游引物 LLR-VP7R，5'-AATGGTCAAGTCGTGGTAG-3'，擴增片段451bp。P基因分型上游引物為5'-GAT GCT TCT AGC ACC AAC ATC AG-3'，下游引物LLR-VP4R，5'-CAG T

13、GAATG GAG TGA ACG AC-3'，擴增片段513bp。羊輪狀病毒疫苗毒株基因全長來自GeneBank，其中VP7片段接收編號為HM800948，VP4接收編號為JQ013506。運用單提RNA的試劑提取輪狀病毒核酸，然后進行預變性，再運用RT-PCR試劑盒做核酸擴增，最后在1％的瓊脂糖膠中電泳。陽性標本的RP-PCR產物送北京市睿博生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI中進行BLAST比對。
　　 結果：

14、　　 1.人口統(tǒng)計學分析2011年9月～2012年10月間，共登記首次接種疫苗兒童121人，其中1人失訪，5人中途退出且無大便標本收集。有標本收集的兒童共115人，共收集標本1172份。男女比例為1.12∶1。
　　 2.輪狀病毒抗原檢測1172份大便標本經EIA檢測，有38(3.2％)份為陽性;115位調查兒童中EIA陽性兒童為16(13.9％)人。在為期14天的調查中，排毒最早發(fā)生在接種疫苗后第1天，最晚發(fā)生在服苗后的第1

15、3天。其中32(82％)份EIA陽性標本集中在服苗后的第5～10天，意味著排毒高峰期為服苗后第5～10天。平均持續(xù)排毒時間為3天，其中僅排毒1天有6(37.5％)人。平均排毒量OD值為0.62，羊輪狀病毒疫苗排毒量約為3.9×105～1.6×106拷貝/ml，平均排毒量約為7.8×105拷貝/ml。
　　 3.RT-PCR基因型分析對16位EIA陽性兒童的177份標本和隨機抽取的7位EIA陰性兒童的61份標本進行RT-PCR檢測

16、。人輪狀病毒RT-PCR篩查結果顯示均為陰性，未見調查對象有偶合感染人輪狀病毒的情況。羊輪狀病毒疫苗毒株篩查結果顯示EIA陰性兒童標本中均為陰性。177份EIA陽性兒童標本中，VP7片段陽性101(57.1％)份，VP4片段陽性103(58.2％)份，兩基因片段合并陽性111(62.7％)份。RT-PCR陽性結果送測序公司測序，結果顯示VP7片段的符合率為96％，VP4片段的符合率為99％，均為羊輪狀病毒疫苗的目的片段。
　　

17、4.安全性分析在跟蹤隨訪的14天內，115位調查兒童有8(7％)人發(fā)生了一過性的輕微不良反應。其中有5人發(fā)生了一過性的輕微發(fā)熱，3人發(fā)生了腹瀉，1人精神萎靡（其中一人同時發(fā)生了發(fā)熱和腹瀉癥狀），未見嚴重的腸套疊和其他明顯的臨床癥狀的發(fā)生。與調查兒童接觸的家庭成員（Household contacts，HHC）共有442人，僅有1人在調查期間發(fā)生了腹瀉癥狀，對該腹瀉患者腹瀉期間收集的7份大便標本經EIA和RT-PCR檢查，未見輪狀病毒疫苗

18、毒株的排出。
　　 結論：
　　 1.我國羊輪狀病毒疫苗在首次接種疫苗后14天內的排毒率為13.9％，95％可信區(qū)間為8.1～21.6％;兒童首次接種疫苗后的14天內均有可能發(fā)生排毒，其中排毒高峰期為接種疫苗后第5～10天;排毒持續(xù)時間最少僅1天，最長的有6天，平均排毒持續(xù)時間為3天。平均排毒量的OD值為0.62，約為7.8×105拷貝/ml?？梢娧蜉啝畈《疽呙绲呐哦韭实停哦境掷m(xù)時間短，排毒量小。
　　 2.研

19、究顯示年齡為影響疫苗排毒的重要因素，其中2～12月齡調查兒童的疫苗排毒率為20.5％，13～24月齡調查兒童的疫苗排毒率為13％，25～36月齡調查兒童未見疫苗排毒?？梢婋S著年齡的增長，疫苗排毒率顯著降低。性別因素對疫苗排毒無影響。
　　 3.對EIA陽性兒童做RT-PCR分析，排毒毒株基因型均為G10P[15]，排毒毒株為蘭州羊輪狀病毒疫苗;未見調查對象在調查期間偶合感染人輪狀病毒的情況。
　　 4.不良反應的發(fā)生率為