斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測腦膜炎球菌、單純皰疹病毒巨細(xì)胞病毒及新型隱球菌抗原實(shí)驗(yàn)方法的建立.pdf

1、目的：建立用斑點(diǎn)酶免疫滲濾法（Dot Immunoenzyme Filtration Assav，DIEFA）檢測腦膜炎雙球菌（A群）、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、新型隱球菌抗原的診斷方法，為進(jìn)一步研制檢測急性腦（膜）炎病原體蛋白芯片試劑盒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.建立用斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的腦膜炎雙球菌（A群）抗原：制備抗原，按二倍順序稀釋法將抗原、抗體及酶標(biāo)抗體稀釋成不同濃度；用方陣滴定法確定所有試驗(yàn)

2、點(diǎn)及其相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)濃度；判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果并用分析軟件讀取光密度值（OD值），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出最佳反應(yīng)組合及反應(yīng)方程。
　　 2.建立用斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的單純皰疹病毒抗原：用二倍順序稀釋法將抗原、抗體及酶標(biāo)抗體稀釋成不同濃度，用方陣滴定法確定所有試驗(yàn)點(diǎn)及其相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)濃度；判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果并用分析軟件讀取光密度值（OD值），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出最佳反應(yīng)組合及反應(yīng)方程。
　　 3.建立用斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的巨細(xì)胞病

3、毒抗原：用二倍順序稀釋法將抗原、抗體及酶標(biāo)抗體稀釋成不同濃度，用方陣滴定法確定所有試驗(yàn)點(diǎn)及其相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)濃度；判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果并用分析軟件讀取光密度值（OD值），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出最佳反應(yīng)組合及反應(yīng)方程。
　　 4.建立用斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的新型隱球菌抗原：制備抗原，用二倍順序稀釋法將抗原、抗體及酶標(biāo)抗體稀釋成不同濃度，用方陣滴定法確定所有試驗(yàn)點(diǎn)及其相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)濃度；判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果并用分析軟件讀取光密度值（OD值），統(tǒng)計(jì)

4、學(xué)分析得出最佳反應(yīng)組合及反應(yīng)方程。
　　 結(jié)果：
　　 1.斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的腦膜炎雙球菌抗原的最佳反應(yīng)濃度：鼠抗（A）群腦膜炎雙球菌多克隆抗體濃度0.125μg/ml（1：800）與抗鼠/兔通用型酶標(biāo)抗體濃度1：10。稀釋抗原建立回歸方程Y=0.4564X+0.0728，相關(guān)系數(shù)r=0.9212（P<0.05），抗原最小檢出濃度33.7 ng/ml（1：3200）：對照均為陰性，無非特異性反應(yīng)。
　　

5、鼠抗（A）群腦膜炎雙球菌單克隆抗體濃度0.3125μg/ml（1：320）與抗鼠/兔通用型酶標(biāo)抗體濃度1：10為最佳反應(yīng)濃度組合；稀釋抗原建立回歸方程Y=0.4828X+0.0689，相關(guān)系數(shù)r=0.9070（P<0.05），抗原最小檢出濃度16.8 ng/ml（1：6400）；對照均為陰性，無非特異性反應(yīng)。
　　 2.斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的單純皰疹病毒抗原的最佳反應(yīng)滴度為：兔抗單純皰疹病毒多克隆抗體濃度8.4μg/ml（1

6、：100）與抗鼠/兔通用型酶標(biāo)抗體濃度1：10。稀釋抗原建立回歸方程Y=0.0984X+0.1310，相關(guān)系數(shù)r=0.8884（P<0.05），抗原最小檢出濃度66.8 ng/ml（1：2048）；對照均為陰性，無非特異性反應(yīng)。
　　 3.斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的巨細(xì)胞病毒抗原的最佳反應(yīng)滴度為：兔抗巨細(xì)胞病毒多克隆抗體濃度12.5μg/ml（1：160）與抗鼠/兔通用型酶標(biāo)抗體濃度1：10。稀釋抗原建立回歸方程Y=0.0440

7、X+0.0576，相關(guān)系數(shù)r=0.9297（P<0.05），抗原最小檢出濃度55.7 μg/ml（1：4096）；對照均為陰性，無非特異性反應(yīng)。
　　 4.斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測已知的新型隱球菌抗原的最佳反應(yīng)滴度為：鼠抗新型隱球菌單克隆抗體濃度2.5μg/ml（1：80）與抗鼠/兔通用型酶標(biāo)抗體濃度1：10。建立不同稀釋濃度的抗原與A值變化關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程Y=0.3528X+0.0693，相關(guān)系數(shù)r=0.8889（P<

8、0.05），抗原最小檢出濃度8.7 ng/ml（1：4096）；對照均為陰性，無非特異性反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 初步建立了用斑點(diǎn)酶免疫滲濾法檢測腦膜炎雙球菌（A群）、單純皰疹病毒抗原、巨細(xì)胞病毒抗原、新型隱球菌抗原的實(shí)驗(yàn)方法。用已知鼠抗A群腦膜炎雙球菌多克隆抗體、單克隆抗體檢測腦膜炎雙球菌抗原反應(yīng)的抗原最小檢出濃度分別為33.7 ng/ml和16.8 ng/ml；已知兔抗單純皰疹病毒多克隆抗體檢測單純皰疹病毒，抗原最