砂梨核微衛(wèi)星位點(diǎn)的開發(fā)和雜交F-,1-代的SSR分析.pdf

1、核微衛(wèi)星(Nuclear Microsatellite，nSSR)是非常有效的分子標(biāo)記工具，廣泛應(yīng)用于植物遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、親緣關(guān)系等研究，但目前梨的nSSR標(biāo)記還很少.因此，本文應(yīng)用精確預(yù)測法進(jìn)行了砂梨核nSSR的開發(fā)，能為梨屬果樹及其近緣種遺傳結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系等方面的研究提供有效工具。 梨是原產(chǎn)于我國的最古老的果樹種類之一，在水果生產(chǎn)中占有重要的地位.但是目前利用SSR技術(shù)構(gòu)建梨遺傳圖譜的研究和應(yīng)用較少，而梨遺傳連鎖圖譜的構(gòu)

2、建和重要農(nóng)藝性狀和基因的定位對于拓展梨屬的基因資源有著重大的意義。故本試驗(yàn)選用西子綠與喜水為雜交親本及其F1代共77個(gè)樣本為作圖群體.運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，初步構(gòu)建了砂梨分子遺傳圖譜.本試驗(yàn)獲得的主要成果如下： 1以硅膠干燥保存的梨夏秋葉片為試材，對基因組DNA提取方法進(jìn)行了研究.通過對CTAB方法的改進(jìn)，提取梨DNA時(shí)不僅快速而且蛋白質(zhì)、RNA、多糖等雜質(zhì)較少，OD260/OD280在1.7-2.0之間，能滿足酶切、PCR等

3、試驗(yàn)的要求.同時(shí)對梅、蘋果、桃、杏等果樹夏秋葉片樣品進(jìn)行了通用性檢驗(yàn)，同樣高效快速地獲得了高質(zhì)量的DNA。 2由于具高變異性、重復(fù)性、共顯性、在真核生物中的豐富性使得SSR成為在DNA指紋圖譜、親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜和群體遺傳分析方面有用的分子工具.但SSR開發(fā)方法的效率限制了它的應(yīng)用.本文利用改進(jìn)的親和捕捉法來富集微衛(wèi)星，并采用精確預(yù)測(AFC)模型來開發(fā)梨SSR分子標(biāo)記.結(jié)果126個(gè)陽性克隆中隨機(jī).挑選60個(gè)，其中38個(gè)克隆

4、獲得了特異的產(chǎn)物富集效率達(dá)到63％；根據(jù)模型推薦的前10個(gè)克隆進(jìn)行測序，10個(gè)序列均為完整的微衛(wèi)星片段，測序效率達(dá)到100％。高效開發(fā)出了梨SSR分子標(biāo)記。 3通過優(yōu)化PCR反應(yīng)的退火溫度和反應(yīng)體系等參數(shù)，篩選多態(tài)性豐富的SSR引物，建立了適合梨的SSR分析技術(shù)體系：梨SSR分析的PCR反應(yīng)體系以251μL為宜，含10×Buffer2.5μL，25mM MgCl21.5μL，2.SmM dNTP1.6μL，15 ng/μL Pr

5、imer各1.0μL，5U/μL Taq聚合酶0.15μL，模板DNA(50 ng/μL)2.0μL.各引物復(fù)性溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，所篩選的12對SSR引物的最佳復(fù)性溫度在45℃到50℃之間。 從40對SSR.引物中篩選獲得在雙親間存在多態(tài)性的引物12對，多態(tài)性比例為30.7％，這些引物適合用于構(gòu)建梨遺傳圖譜的SSR分析。 4應(yīng)用JoinMap3.0軟件，初步構(gòu)建了西子綠×喜水梨共4個(gè)遺傳連鎖群，包括12個(gè)孟德爾分離標(biāo)