ERK1-2參與外源性bFGF對放射性腦損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、放射性腦損傷(radiation injuries，brain；RIB)在臨床上常見于原發(fā)或繼發(fā)的頭頸部腫瘤放射治療后，也可由工業(yè)生產(chǎn)中放射事故性損傷引發(fā)。當RIB一旦形成并產(chǎn)生臨床癥狀時在病程中往往已進入不可逆階段，不僅嚴重影響患者生存質(zhì)量，也給患者的家庭和社會帶來沉重負擔(dān)。目前臨床對RIB治療以脫水劑、激素及對癥支持治療為主，無法從根本上逆轉(zhuǎn)其病情變化，所以尋找有效的治療方法十分必要。本課題組前期實驗已證實堿性成纖維生長因子(bas

2、ic fibroblast growth factor，bFGF)可抑制輻射誘導(dǎo)的C17.2神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)凋亡，并對RIB有一定的治療作用，然而其具體作用機制尚不明確。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)的

3、一種，處于多條信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且是bFGF與其受體結(jié)合后所激活通路的中心環(huán)節(jié)，對其進行適當調(diào)控有望為RIB治療提供新的思路。本課題擬從離體NSC到活體動物實驗，對ERK1/2在bFGF對輻射誘導(dǎo)的NSC凋亡的調(diào)控作用及在體RIB的保護作用進行觀察，以期進一步明確bFGF治療RIB的可能機制，為尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。本實驗內(nèi)容分為三部分： 1、ERK1/2參與bFGF抑制輻射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡的作用研究；

4、 2、直線加速器全腦分割照射建立放射性腦損傷模型； 3、ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與外源性bFGF對放射性腦損傷的保護作用。 研究目的： 觀察外源性bFGF對放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡的影響，探討ERK1/2在bFGF對放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡的抑制效應(yīng)中的作用。 研究內(nèi)容： 采用nestin免疫細胞化學(xué)染色鑒定C17.2NSCs。MTT法檢測外源性bFGF對C17.2 NSCs

5、細胞活性的影響，利用流式細胞儀檢測放射后早期凋亡，尋找出有效bFGF濃度后，進一步加入MEK通路的特異性阻斷劑U0126，Western blot法檢測FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2在C17.2 NSCs的表達。 結(jié)果： 1.NSCs培養(yǎng)鑒定：免疫細胞化學(xué)染色顯示95％NSCs呈Nestin陽性染色； 2.外源性bFGF抑制放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡：流式細胞儀檢測結(jié)果顯示隨著bFGF濃度增加細

6、胞凋亡率明顯降低，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。bFGF濃度為50ng/ml時已可逆轉(zhuǎn)大部分8Gy射線誘導(dǎo)的細胞凋亡，100ng/ml時對C17.2NSCs凋亡的抑制作用最明顯，以100ng/ml作為有效濃度進行下一步實驗。 3.ERK1/2在外源性bFGF抑制放射誘導(dǎo)的C17.2NSCs凋亡中的作用研究：加入bFGF培養(yǎng)后，可誘導(dǎo)C17.2NSCs表達FGFR1，且ERK1/2、p-ERK1/2蛋白均呈陽性表達；加入MEK1/2特異性抑

7、制劑U0126后，bFGF誘導(dǎo)細胞表達的FGFR1和ERK1/2蛋白表達水平未受明顯影響，p-ERK1/2蛋白表達水平明顯減少。 結(jié)論： 建模后采用尾靜脈直接注射給藥法對模型鼠給予外源性bFGF、U0126、DMSO，進行學(xué)習(xí)記憶能力檢測，免疫組織化學(xué)染色和Western Blot免疫蛋白印跡方法檢測大鼠海馬FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達，HE染色和GFAP、CNPase免疫組織化學(xué)染色觀察組織病理

8、學(xué)改變。 結(jié)果： 1.學(xué)習(xí)記憶能力檢測：各處理組與模型組相比，學(xué)習(xí)記憶能力有顯著改善(P<0.01)；U0126組學(xué)習(xí)記憶能力明顯較bFGF治療組及DMSO組差(P<0.01)，但DMSO組與bFGF治療組比較則無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 2.FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2檢測結(jié)果：免疫組化及Western blot檢測檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬有微弱FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋

9、白表達；bFGF治療組、U0126組及DMSO組大鼠海馬內(nèi)FGFR1、ERK1/2蛋白表達水平相近，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但均較模型組明顯增多(P<0.01)；bFGF治療組及DMSO組大鼠海馬內(nèi)p-ERK1/2蛋白表達無明顯差別(P>0.05)，但較模型組和U0126組明顯增大(P<0.01)，U0126組亦顯著大于模型組(P<0.01)。 3.組織病理學(xué)檢測：HE染色顯示，組織損傷以模型組最為嚴重，其次為U0126組

10、，bFGF治療組與DMSO組相比差異不明顯；bFGF治療組GFAP平均陽性灰度值明顯大于模型組(P<0.05)及U0126組(P<0.01)，與DMSO組相比則無明顯差異(P>0.05)，且與模型組相比，其它三組GFAP陽性細胞著色深且均勻，突起多、長；bFGF治療組CNPase平均陽性灰度值明顯大于模型組及U0126組(P<0.05)，與DMSO組相比則無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： 外源性bFGF經(jīng)尾靜脈注入R