積雪草總苷緩釋片的處方設(shè)計(jì)及其藥動學(xué)研究.pdf

1、積雪草在我國作為藥用植物使用已有二千余年歷史，為《中國藥典》收載的常用中藥材。本課題以積雪草的水溶性有效部位(積雪草總苷含量大于60％)為模型藥物進(jìn)行中藥緩釋制劑的處方設(shè)計(jì)及體外處方優(yōu)化研究，進(jìn)一步通過該藥材體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)創(chuàng)新測定方法的建立，對該積雪草總苷緩釋片進(jìn)行了比格犬的藥動學(xué)考察，研究了積雪草總苷緩釋片在體內(nèi)的藥動學(xué)變化、進(jìn)行了生物等效性評價(jià)，研究結(jié)果為今后中藥口服緩釋制劑的處方設(shè)計(jì)、優(yōu)化以及體內(nèi)外評價(jià)方法提供了一定的理論依據(jù)和實(shí)踐

2、依據(jù)。本課題主要從以下幾個(gè)方面開展實(shí)驗(yàn)： 一、可同時(shí)測定積雪草總苷緩釋片中2個(gè)指標(biāo)成分——積雪草苷和羥基積雪草苷RP-HPLC分析方法的建立本項(xiàng)研究以積雪草的水溶性有效部位(積雪草總苷含量大于60％，含量以積雪草苷和羥基積雪草苷之和計(jì))為模型藥物進(jìn)行中藥緩釋制劑的處方設(shè)計(jì)研究。以反映主要藥效的2個(gè)指標(biāo)成分——積雪草苷(asiaticoside，AS)和羥基積雪草苷(madecassoside，MS)的釋放控制為制劑研究主要目標(biāo)，

3、本實(shí)驗(yàn)首先建立了可同時(shí)測定積雪草苷和羥基積雪草苷的RP-HPLC方法。以DIAMONSILC18(250mm*4.6mm，5μm)為色譜柱，乙腈-甲醇-水(22：35：50)為流動相，柱溫控制在25℃，流速0.8ml/min，檢測波長為204nm，可同時(shí)用于釋放液中AS和MS分離測定。方法學(xué)評價(jià)結(jié)果顯示，積雪草總苷中MS和AS的峰面積與濃度之間呈良好的線性(濃度范圍均為2～200μg/ml，r=0.9999)，方法的回收率MS為99.9

4、～101.0％，AS為100.3～103.1％(n=6)，日內(nèi)日間精密度小于1.9％。本方法可同時(shí)測定積雪草總苷緩釋片釋放液中的2個(gè)指標(biāo)成分。方法專屬性強(qiáng)，快速簡單，重現(xiàn)性好。 二、積雪草總苷緩釋片的處方設(shè)計(jì)和優(yōu)化采用擬水平的均勻設(shè)計(jì)表U*66設(shè)計(jì)緩釋制劑處方，RP-HPLC方法直接測定制劑中反映積雪草主要藥效的2個(gè)指標(biāo)成分——積雪草苷和羥基積雪草苷的釋放度，利用指標(biāo)成分的體外釋放度及其特性參數(shù)與各輔料之間的回歸方程(處方方程)

5、對處方進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化處方為：積雪草總苷為18mg/片，各輔料的組成為：羥丙基甲基纖維素(HPMC)30～75mg/片、微晶纖維素(MCC)50mg/片、7.5％聚維酮(PVP)醇溶液時(shí)，該處方可使指標(biāo)成分在水中緩慢釋放。 三、積雪草總苷緩釋片體內(nèi)分析方法的建立選擇積雪草酸作為積雪草總苷緩釋片的體內(nèi)檢測指標(biāo)。積雪草苷在體內(nèi)經(jīng)二相代謝成積雪草酸起效，而積雪草酸在體內(nèi)以大量結(jié)合物(約72％為葡醛酸結(jié)合物、18％為硫酸酯結(jié)合物

6、)的形式存在，我們采用將含藥血漿酸水解后測定積雪草酸總濃度的方法進(jìn)行研究。首先以ED為催化劑、對甲苯胺為衍生化試劑，對生物樣品中的微量積雪草酸進(jìn)行柱前衍生化，初步獲得了靈敏度較高可用于HPLC-UV檢測的衍生化產(chǎn)物。采用HPLC-MS等方法初步確證了衍生化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，我們對血漿水解時(shí)間、衍生化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對內(nèi)標(biāo)、血樣提取方法、色譜方法等條件進(jìn)行篩選，最終選擇熊果酸為內(nèi)標(biāo)，正己烷/CH2Cl2/異丙醇混合溶劑

7、為提取溶劑，甲醇-水為流動相經(jīng)梯度洗脫的柱前衍生化的RP-HPLC方法。 色譜條件如下： 色譜柱為DIKMAC18(250mm*4.6mm，5μm)；流動相為甲醇和水；梯度洗脫，程序設(shè)定如表1；流速：1.0ml/min；檢測波長：248nm；進(jìn)樣量：50μl；柱溫：25℃。Tab1TheprocedureofgradientoperationinHPLCTime(min)Ratioofmethanol/water085％

8、885％3692％37100％43100％ 方法學(xué)考察結(jié)果表明，積雪草酸在0.01-1.5μg/ml濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(Y=6.4361X+0.221，r=0.9996)，定量下限為0.01μg/ml(RSD=14.2％，n=5)；低、中、高三檔濃度的方法回收率分別為105.1％、101.9％和101.6％，日內(nèi)精密度分別為4.4％、5.8％、12.5％，日間(連續(xù)5天)精密度分別為4.6％、6.2％、14.2％。凍融

9、試驗(yàn)表明，樣品在30天內(nèi)穩(wěn)定?？傊⒌腍PLC方法專屬性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確度好、靈敏度高、方便等特點(diǎn)，完全可滿足積雪草總苷緩釋片的體內(nèi)藥動學(xué)測定。 四、體內(nèi)藥動學(xué)以5只成年健康比格犬為受試對象進(jìn)行雙周期給藥設(shè)計(jì)。5只比格犬首先口服參比制劑(普通制劑，含總苷540mg)，采血時(shí)間為0.5h，1.5h，2.5h，3.5h，4.5h，5.5h，6.5h，8h，10h，12h，18h，24h，36h。清洗期結(jié)束后，給服受試制劑(積雪草總

10、苷緩釋片，含總苷540mg)，采血時(shí)間同參比制劑。血漿樣本進(jìn)行按所確定的“積雪草總苷緩釋片體內(nèi)分析方法”進(jìn)行分析和測定。 血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用PKSV1.0軟件進(jìn)行藥動學(xué)擬合統(tǒng)計(jì)，AIC法(Akaike'sinformationcriterion)和F檢驗(yàn)判別分別對藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。 藥動學(xué)結(jié)果表明，積雪草總苷緩釋片的體內(nèi)過程符合一室模型。主要藥動學(xué)參數(shù)為：參比制劑t1/2=4.29h，tmax=2.7h，Cmax=

11、0.74μg/ml，AUC0～t=3.74μg.h/ml，MRT=6.20h；受試制劑t1/2=10.29h，tmax=7.4h，Cmax=0.27μg/ml，AUC0～t=3.69μg.h/ml，MRT=16.81h。以上結(jié)果表明，受試制劑的tmax、t1/2、MRT明顯延長，Cmax明顯降低，表明緩釋片具有良好的緩釋效果，所研究的緩釋片基本達(dá)到日服1次給藥的目的。 五、生物等效性將Cmax、AUC0～t經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分

12、析及雙單側(cè)t檢驗(yàn)(α=0.05)，以AUC：80％～125％和Cmax：70％～143％為判定標(biāo)準(zhǔn)，考察兩制劑是否具有生物等效性。相對生物利用度以AUC(緩釋片)/AUC(參比)進(jìn)行計(jì)算。 研究結(jié)果表明，受試制劑積雪草總苷緩釋片的相對生物利用度為(99.30±9.60)％，受試制劑和參比制劑的AUC0～t無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P>0.05)，且受試制劑AUC0～t的90％置信區(qū)間為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的83.24％～121.8％，符合

13、80～125％的范圍，因此判斷兩種制劑吸收程度生物等效。 另外，經(jīng)檢驗(yàn)，受試制劑和參比制劑的Cmax具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05)，受試制劑Cmax的90％置信區(qū)間已超出了參比制劑70％～143％的范圍，結(jié)果表明兩種制劑Cmax不符合生物等效性要求，受試制劑具有緩釋特征。 Tmax的生物等效性采用非參數(shù)法(WilcoxonSignedRanksTest)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果z=-2.04124，其中P=0.041227<

14、0.05，說明兩種制劑有顯著性差異。 總之，以反映主要藥效的指標(biāo)成分的釋放控制為目標(biāo)的處方設(shè)計(jì)和優(yōu)化技術(shù)，創(chuàng)新的體內(nèi)積雪草物質(zhì)基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，我們以積雪草的水溶性有效部位為模型藥物進(jìn)行中藥緩釋設(shè)計(jì)的處方設(shè)計(jì)研究，比較了積雪草總菅緩釋片與常釋制劑在比格犬的藥動學(xué)，評價(jià)了緩釋片與常釋制劑的生物等效性。結(jié)果表明：優(yōu)化后的積雪草總苷緩釋片其吸收程度與普通制劑生物等效，其tmax、t1/2、MRT顯著延長，Cmax顯著降低，顯示積雪草總苷