血漿置換治療重型肝炎的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討血漿置換(Plasma Exchange，PE)治療對(duì)重型肝炎患者血清中內(nèi)毒素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)的清除作用，并用標(biāo)本血清干預(yù)大鼠枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)，比較PE治療前后血清對(duì)枯否細(xì)胞表達(dá)TGF-β1的影響，為研究重型肝炎的發(fā)病機(jī)制及PE治療重型肝炎的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:1.20例重型肝炎患者血清標(biāo)本來(lái)自瀘醫(yī)附院感

2、染科自2007年3月至2007年7月期間的住院病例。重型肝炎診斷符合2000年《病毒性肝炎防治方案》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所選病例均符合人工肝支持系統(tǒng)(Artificial liver support system，ALSS)PE治療的適應(yīng)癥，運(yùn)用plasauto IQ型血漿置換治療儀(日本旭醫(yī)療株式會(huì)社，中空纖維膜型血漿分離器OP-08W進(jìn)行治療。PE治療前、后均采外周血，一份立即送檢驗(yàn)科進(jìn)行肝功能指標(biāo)、凝血功能檢查，另一份離心分離血清，置于-

3、80℃冰箱保存，最后集中檢測(cè)內(nèi)毒素和TGF-β1細(xì)胞因子。20例對(duì)照組血清來(lái)自健康志愿者。2.標(biāo)本血清內(nèi)毒素含量測(cè)定。采用鱟試劑(tachypleus amebocytelysate，TAL)的合成基質(zhì)偶氮顯色法原理進(jìn)行檢測(cè)。3.標(biāo)本血清TGF-β1含量測(cè)定。采用ELISA酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)。4.健康志愿者及重型肝炎患者PE前、后肝功能指標(biāo)(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST、血清總膽紅素TBIL、直接膽紅素DBIL)及凝血功

4、能(凝血酶原時(shí)間PT，凝血酶原活動(dòng)度PTA)的檢測(cè)，使用全自動(dòng)生化儀及血凝儀進(jìn)行檢測(cè)，由瀘醫(yī)附院檢驗(yàn)科完成。5.枯否細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定:采用Ⅳ型膠原酶灌注、Percoll細(xì)胞分離液密度梯度離心及選擇性貼壁分離純化枯否細(xì)胞，并在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，采用碳素墨水吞噬試驗(yàn)、過(guò)氧化物酶染色進(jìn)行KCs鑒定。6.實(shí)驗(yàn)分組。分三組:(1)PE前組:分離培養(yǎng)24小時(shí)的枯否細(xì)胞加重型肝炎患者PE前血清與等量RPMI-1640液配成的培養(yǎng)液培養(yǎng)2

5、4小時(shí)。(2)PE后組:分離培養(yǎng)24小時(shí)的枯否細(xì)胞加重型肝炎患者PE后血清與等量RPIM-1640液配成的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。(3)健康對(duì)照組:分離培養(yǎng)24小時(shí)的枯否細(xì)胞加健康志愿者血清與等量RPMI-1640液配成的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。7.在標(biāo)本血清干預(yù)24小時(shí)后采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法比較PE前后血清對(duì)大鼠枯否細(xì)胞表達(dá)TGF-β1的影響。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法: 結(jié)果：采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±

6、SD)表示。三組樣本間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)。結(jié)果:1.所選重型肝炎患者血清中均檢測(cè)到內(nèi)毒素，PE前血清中內(nèi)毒素為(0.4034±0.108)EU/mL，治療后降至(0.2284±0.082)EU/mL，對(duì)照組為(0.0784±0.026)EU/mL。PE前組及治療后組與對(duì)照組比較，治療前后比較P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.PE前血清中TGF-β1含量為(0.64±0.29)ng/mL，治療后降至(

7、0.41±0.27)ng/mL，對(duì)照組為(0.11±0.06)ng/mL，三組樣本間比較采用單因素方差分析，P<0.01，差異具有顯著性。3.重型肝炎患者PE前后肝功能比較，ALT從(453.24±670.7)U/L降至(146.24±175.9)U/L；AST從(383±433.8)U/L降至(176.5±165.6)U/L；TBIL從(307.5±183.2)μmol/L降至(206.3±140.8)μmol/L；DBIL從(195

8、.2±108)gmol/L降至(132.1±82.4)μmol/L，治療前后比較差異有顯著性(P<0.05)。凝血功能比較，治療前PT為(31.9±11.5)秒、PTA(31.5±12.7)％，PE后凝血功能明顯改善，PT為(21.9±6.3)秒、PTA為(48.8±13.4)％，治療前后比較差異有顯著性(P<0.05)。4.原代分離大鼠枯否細(xì)胞，每只大鼠細(xì)胞得率為8×106個(gè)，經(jīng)0.4％的臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞活率為98％。通過(guò)碳素墨水吞噬

9、實(shí)驗(yàn)鑒定所分離培養(yǎng)的細(xì)胞93％以上為枯否細(xì)胞，96％的細(xì)胞過(guò)氧化物酶染色陽(yáng)性。5.免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用含50％重型肝炎患者PE前、后血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)枯否細(xì)胞24小時(shí)后，其治療前組TGF-β1的表達(dá)明顯高于治療后組(P<0.05)。與對(duì)照組比較，治療后組枯否細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)。 結(jié)論:1.重型肝炎患者存在內(nèi)毒素血癥，PE治療可有效清除患者血漿中內(nèi)毒素。2.重型肝炎患者血漿中TGF-β1水平升高，

10、PE治療可降低血漿中TGF-β1含量。3.PE治療后血清中ALT、AST、TBIL、DBIL明顯降低，PT、PTA明顯改善。4.以肝門(mén)靜脈為流入道的Ⅳ型膠原酶灌注法、Percoll細(xì)胞分離液密度梯度離心及選擇性貼壁法能有效分離枯否細(xì)胞。5.重型肝炎患者PE治療后血清干預(yù)組中大鼠枯否細(xì)胞TGF-βl的表達(dá)明顯減少，以上表明PE可能通過(guò)有效清除內(nèi)毒素、TGF-β1、血清膽紅素等毒性物質(zhì)，減少了體內(nèi)枯否細(xì)胞TGF-β1的后續(xù)表達(dá)，從而減輕或打